常英英　高亞南　梁立雄　丁昌俊　蘇曉華　張冰玉

(國家林業(yè)局林木培育重點實驗室(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所)，北京，100091)

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AtDME1化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建及其瞬時表達(dá)1)

常英英高亞南梁立雄丁昌俊蘇曉華張冰玉

(國家林業(yè)局林木培育重點實驗室(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所)，北京，100091)

以擬南芥去甲基化轉(zhuǎn)移酶基因DME1為目的基因，采用酶切、連接和重組反應(yīng)的方法構(gòu)建了以17-β-雌二醇為誘導(dǎo)劑的植物表達(dá)載體pER8-DME1。將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404菌株中，通過煙草瞬時表達(dá)技術(shù)，對該載體的誘導(dǎo)表達(dá)特性進(jìn)行了研究。qPCR結(jié)果表明，較低濃度的17-β-雌二醇處理能夠有效調(diào)控pER8-DME1中目的基因的表達(dá)，誘導(dǎo)處理后目的基因表達(dá)量逐漸升高，在12 h后達(dá)到最高，之后緩慢下降。該載體的成功構(gòu)建為深入研究DNA去甲基化與植物的生殖發(fā)育調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

pER8-DME1；17-β-雌二醇；化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)載體；瞬時表達(dá)

Dethylansferase geneDME1 fromArabidopsisthalialawas used as the target gene, and digestion, ligation and recombination reaction methods were applied for constructing the plant expression vector pER8-DME1, which could be induced by 17-β-estradiol. The vector was transferred toAgrobacteriumtumefaciensLBA4404, and the inducible expression characteristics were verified by the transient expression system ofNicotianatabacum. By qPCR, low concentration of 17-β-estradiol could be effective for the expression of the target gene in pER8-DME1 vector. The expression level ofDME1 gene gradually increased with 17-β-estradiol treating time and reached the highest level at 12 h.

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，在生物體內(nèi)相對穩(wěn)定且可遺傳，參與了多種生物學(xué)過程，如胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、基因組印記、基因的表達(dá)調(diào)控等[1-4]。DNA甲基化的模式和水平主要靠DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的作用調(diào)節(jié)。目前的研究表明，植物中的甲基化轉(zhuǎn)移酶主要有甲基化轉(zhuǎn)移酶1(MET1)[5]、結(jié)構(gòu)域重排甲基轉(zhuǎn)移酶(DRM)[6]和染色質(zhì)甲基化酶(CMT3)[7]3類；植物DNA去甲基化酶包括DME、ROS1、DML2和DML3等4個家族，它們均含有最保守的DNA糖基化酶結(jié)構(gòu)域[8-10]。DNA去甲基化酶通過堿基切除修復(fù)機制在DNA主動去甲基化中發(fā)揮作用，其中，DME是雙功能團(tuán)的糖苷酶，具有DNA糖基化酶和AP(apurillic/apyrimidinic)裂解酶活性，最終使5-甲基胞嘧啶(5mC)被胞嘧啶代替[11-12]。目前，僅在雙子葉植物中發(fā)現(xiàn)DME，其主要在雌配子體的中央細(xì)胞和助細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)[13]。此外，DME也在擬南芥胚乳發(fā)育過程基因組印記建立中發(fā)揮作用。IKEDA et al.[14]在擬南芥的種子發(fā)育階段發(fā)現(xiàn)，DME在中央細(xì)胞中的特異性表達(dá)，使印記基因FAW、MEA、MPC和FIS2等發(fā)生去甲基化，導(dǎo)致受精后胚乳的甲基化水平降低，從而建立了胚和胚乳的發(fā)育之間甲基化的不對稱結(jié)構(gòu)。與甲基化酶基因相比，DME基因在植物生長發(fā)育中的作用研究還有待于進(jìn)一步深入。

化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是研究基因功能的有效手段之一[16]。其中，類固醇激活系統(tǒng)是基于糖皮質(zhì)激素受體、雌激素受體等建立的較為精密化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，其主要是通過糖皮質(zhì)激素受體、雌激素受體作為轉(zhuǎn)錄激活因子與融合啟動子結(jié)合，來調(diào)控下游基因的表達(dá)。當(dāng)類固醇存在時，受體從細(xì)胞質(zhì)中的熱休克蛋白90(HSP90)中解離出來，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，并與融合啟動子結(jié)合，激活目的基因的表達(dá)。2000年，ZUO et al.[17]構(gòu)建了雌激素激活表達(dá)系統(tǒng)(XVE系統(tǒng))，該系統(tǒng)能夠精密的調(diào)控下游基因的表達(dá)，并且對植物沒有毒害作用，是研究基因功能的理想工具。本研究以擬南芥甲基化轉(zhuǎn)移酶基因DME1為目的基因，構(gòu)建了以17-β-雌二醇為誘導(dǎo)劑的XVE系統(tǒng)載體pER8-DME1，將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404菌株中，通過煙草瞬時表達(dá)，對該載體的誘導(dǎo)表達(dá)特性進(jìn)行了研究，為研究DNA甲基化與表型變化之間的相互關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

煙草(NicotianatabacumL.)由中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所盧孟柱課題組饋贈。播種于土壤中，并將其放入人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度(26±1)℃、光照16 h·d-1、光強50 μmol·m-2·s-1)。60 d后用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時表達(dá)。

含有雌二醇誘導(dǎo)型啟動子的pER8-GFP質(zhì)粒由Nam. Hai Chua博士(The Rockefeller University, USA)贈送，含擬南芥DME1基因cDNA的pET30b-DME1質(zhì)粒由Roldán-Arjona博士(Universidad de Córdoba,Spain)贈送。農(nóng)桿菌LBA4404為本實驗室保存。

1.1DME1誘導(dǎo)表達(dá)載體構(gòu)建

DME1基因cDNA全長為5 964 bp，將其分成3段D3、D1-1和D1-2，用酶切、連接結(jié)合重組反應(yīng)的方法將DME1基因整合到pER8載體中。PCR反應(yīng)的引物見表1，下劃線分別為XhoⅠ和SpeⅠ的識別位點。

注：下劃線分別為XhoⅠ和SpeⅠ的識別位點。

以pET30b-DME1質(zhì)粒為模版，用DME1全長引物(DME1-F、DME1-R)PCR擴(kuò)增DME1基因的cDNA全長。采用TA克隆的方法將DME1重組到pMDTM19-T Vector(Takara公司，日本)。轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆進(jìn)行序列測定。

用XhoⅠ和SpeⅠ(NEB公司，美國)雙酶切pMD19-T-DME1和pER8-GFP，酶切回收的D3片段和pER8線性片段，用T4 DAN酶(NEB公司，美國)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測，所用引物為pER8載多克隆位點通用引物pXhoⅠ-F和pSpeⅠ-R，獲得中間載體pER8-D3(圖1)。并用XhoⅠ單酶切pER8-D3質(zhì)粒，獲得線性化的pER8-D3備用。

以pET30b-DME1質(zhì)粒為模版，分別以D1-1F、D1-1F和D1-2F、D1-2F為引物，擴(kuò)增D1-1和D1-2片段，分別純化后，按照無縫連接試劑盒的說明書的方法，與線性化的pER8-D3片段混合，進(jìn)行重組反應(yīng)。將全部重組混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，在瓊脂培養(yǎng)板經(jīng)過抗性篩選，陽性克隆PCR驗證后提取質(zhì)粒，最終獲得pER8-DME1載體(圖2)。

1.2pER8-DME1載體的誘導(dǎo)表達(dá)特性

煙草的處理方法：用電擊法分別將質(zhì)粒pER8-GFP、pER8-DME1轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，得到1#和2#菌株；在含Rif(50 mg/L)和Spectinomycin(50 mg/L)的YEP培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于28 ℃，200 r/min培養(yǎng)直至OD600為0.4～0.6。先用1#農(nóng)桿菌注射煙草葉片，26 ℃控濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，再用17-β-雌二醇涂抹煙草葉面，濃度處理分別為0、0.08、0.2、1、5、25、50、100和200 μmol/L，12 h之后打孔取葉片，每個處理3次重復(fù)，每次重復(fù)約取樣100 mg，立即投入液氮中，保存于-80 ℃冰箱中。以50 μmol/L 17-β-雌二醇處理煙草葉面，本別于0、0.5、1、3、6、12、24、48、96 h后取樣。

圖1　中間載體pER8-D3的構(gòu)建

用2#農(nóng)桿菌注射煙草葉片，共培養(yǎng)12 h后用17-β-雌二醇涂抹煙草葉面，濃度處理為0、1、25、50、100、和200 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)12 h之后取樣。采用篩選出DME1基因的最佳17-β-雌二醇濃度，以涂抹的方法處理煙草葉面，處理時間分別為0、1、6、12、24和48 h，取樣及保存方法同上。該材料用于檢測pER8-DME1載體中DME1基因的誘導(dǎo)表達(dá)情況。

圖2　融合載體pER8-DME1的構(gòu)建

總RNA提取及cDNA合成：使用Qiagen公司RNeasy Plant Mini Kit試劑盒提取不同處理的葉片總RNA，用NaNo Drop 8000分光光度計測RNA的濃度和純度。采用Reverse transcriptase-PCR方法合成cDNA具體反應(yīng)過程參照Promega公司的說明書進(jìn)行。

實時定量PCR反應(yīng)：以獲得的不同處理的cDNA稀釋20倍的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用Roche LightCycle 480Ⅱ型熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。以actin為內(nèi)參基因序列(定量引物為5’-T GTGTTGGACTCTGGTGATG-3’和5’-CGCTCGGTA-

AGGATCTTCATC-3’)，DME1基因qPCR引物為：5’-TGTGGGTATGGTAAATGGTCC-3’和5’-AAAGAGGCTTGTT ACACGCTG-3’，GFP基因qPCR引物為：5’-TGTTCCATGGCCAACACTTG-3’和5’-ACGTGTCTTG TAGTTCCCGT-3’。應(yīng)用2-ΔΔCt算法進(jìn)行分析[18]。

2　結(jié)果與分析

2.1誘導(dǎo)表達(dá)載體pER8-DME1的構(gòu)建

2.1.1pER8-D3中間載體的構(gòu)建

用DME1全長引物擴(kuò)增pET30b-DME1質(zhì)粒，獲得了長度為5 964 bp的DME1基因cDNA全長。用TA克隆的方法把DME1序列連入T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行藍(lán)白班篩選，挑取6個單克隆PCR檢測，其中2個為陽性克隆，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為5 964 bp(圖3A)。將其中一個陽性克隆送至上海美吉測序，結(jié)果與GenBank中DME1的序列一致。提取pMDTM19-T-DME1質(zhì)粒后用XhoⅠ和SpeⅠ進(jìn)行雙酶切，將DME1切成2個小片段D1和D3，片段大小分別為4 782 bp和1 182 bp(圖3B)。將D3片段連入pER8載體中，獲得的pER8-D3中間載體構(gòu)，用pXhoⅠ-F和pSpeⅠ-R引物PCR驗證，擴(kuò)增片段與D3大小相等(圖3C)。

A.pMDTM19-DME1的PCR檢測(M：1 kb Marker，1-6：6個單克隆的PCR電泳結(jié)果)；B.T-DME1質(zhì)粒雙酶切(M：1 kb Marker，1：D3片段1 182 bp，2：pMDTM19-T vector線性片段，3：D1(D1-1+D1-2)片段4 782 bp)；C.pER8-D3中間載體的PCR檢測(M：1 kb Marker，水：以H2O為模板的PCR產(chǎn)物，pD3：以pER8-D3質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物)。

圖3pER8-D3中間載體構(gòu)建

2.1.2pER8-DME1載體的構(gòu)建

根據(jù)無縫連接試劑盒反應(yīng)原理設(shè)計D1片段的分段PCR引物，PCR擴(kuò)增獲得D1片段的兩個小片段D1-1(2 812 bp)和D1-2(1 982 bp)。將膠回收的D1-1、D1-2以及pER8-D3線性片段與無縫連接試劑盒中Seamless Master Mix混合，反應(yīng)后經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化和抗性篩選，提取重組質(zhì)粒，以pXhoⅠ-F和pSpeⅠ-R引物進(jìn)行PCR驗證，PCR產(chǎn)物大小約為6 006 bp，與DME1加引物序列的長度相符(圖4)。質(zhì)粒測序結(jié)果表明，pER8-DME1中DME1序列正確，插入位點準(zhǔn)確無誤，載體構(gòu)建成功。

M.1 kb Marker；0.以H2O為模板的PCR產(chǎn)物；pDME.以pER8-DME1質(zhì)粒為模版的PCR產(chǎn)物。

圖4重組質(zhì)粒pER8-DME1的PCR驗證

2.2化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)載體中DME1的誘導(dǎo)表達(dá)特性

2.2.1最佳誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)時間的確定

將含有pER8-GFP質(zhì)粒的LBA4404菌株注射到煙草中，共培養(yǎng)12 h后檢測不同濃度17-β-雌二醇處理下GFP基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，17-β-雌二醇能有效誘導(dǎo)煙草瞬時表達(dá)系統(tǒng)中GFP的表達(dá)，隨著17-β-雌二醇濃度增加，GFP的表達(dá)量逐漸增加。17-β-雌二醇濃度為0.2 μmol/L即可檢測到GFP基因的表達(dá)，25 μmol/L時GFP基因的表達(dá)量顯著增加，濃度達(dá)到100 μmol/L后，GFP的表達(dá)量增加趨勢趨于平緩，因此，我們確定有效誘導(dǎo)劑濃度為5～50 μmol/L(表2)。

表2　在不同濃度17-β-雌二醇誘導(dǎo)后基因的相對表達(dá)量

注：CK1為未注射農(nóng)桿菌，CK2為沒有進(jìn)行誘導(dǎo)處理；ND為未檢到熒光信號；表中表達(dá)量的數(shù)值為2-ΔΔCt的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

我們采用qPCR方法檢測了在煙草瞬時表達(dá)體系中XVE系統(tǒng)的目的基因表達(dá)水平隨17-β-雌二醇處理時間變化的趨勢。結(jié)果表明，1 h時即能檢測到誘導(dǎo)表達(dá)，隨著17-β-雌二醇處理時間的增加，GFP的表達(dá)量逐漸增加，6 h時GFP的表達(dá)量顯著增加，12 h時表達(dá)量最大，之后逐漸降低(表3)。

2.2.2植物表達(dá)載體pER8-DME1中DME1的誘導(dǎo)表達(dá)特性

在此基礎(chǔ)上，我們采用煙草瞬時表達(dá)體系對構(gòu)建好DME1基因的植物化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，1～200 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，17-β-雌二醇能夠有效誘導(dǎo)DME1的表達(dá)，并且隨著17-β-雌二醇濃度增加，DME1的表達(dá)量逐漸增加，17-β-雌二醇濃達(dá)到100 μmol/L后，DME1的表達(dá)量進(jìn)入平臺期(表2)。因此，較低濃度的17-β-雌二醇也能有效誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)，說明該載體對誘導(dǎo)劑的反應(yīng)較為靈敏。但在同樣濃度條件下，DME1的表達(dá)量比GFP要低。

在100 μmol/L的17-β-雌二醇處理下，煙草葉片中DME1的表達(dá)量隨處理時間而逐漸增加，處理1 h后DME1即有少量表達(dá)，6 h后表達(dá)量略有上升，在處理12 h后表達(dá)量達(dá)到最高，之后緩慢下降(表3)。其表達(dá)模式與GFP相似，但表達(dá)量較GFP要低。

表3　17-β-雌二醇在不同處理時間后基因的相對表達(dá)量

注：CK1為未注射農(nóng)桿菌，CK2為沒有進(jìn)行誘導(dǎo)處理；ND為未檢到熒光信號；表中表達(dá)量的數(shù)值為2-ΔΔCt的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

3　結(jié)論與討論

為了更加深入研究AtDME1基因在植物DNA去甲基化過程中的作用，選用雌激素激活系統(tǒng)構(gòu)建了受17-β-雌二醇誘導(dǎo)表達(dá)的pER8-DME1雙元載體，并利用煙草的瞬時表達(dá)技術(shù)和qRT-PCR技術(shù)，檢測了該系統(tǒng)中DME1隨17-β-雌二醇處理條件變化的趨勢。研究結(jié)果表明，較低濃度的17-β-雌二醇即能有效誘導(dǎo)DME1的表達(dá)，處理12 h后表達(dá)量最高。ZUO et al[17]在擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中研究發(fā)現(xiàn)，17-β-雌二醇處理濃度為5 μmol/L、處理時間為24 h時，XVE系統(tǒng)中目的基因表達(dá)量最大。而本研究中17-β-雌二醇濃度提高到50～100 μmol/L時，目的基因表達(dá)量才能達(dá)到最大，可能是因為本研究中誘導(dǎo)劑處理的方法為葉片涂抹法，誘導(dǎo)劑容易揮發(fā)，導(dǎo)致處理濃度降低；而擬南芥轉(zhuǎn)基因研究中誘導(dǎo)劑處理的方法為根部吸收，這能為植物提供穩(wěn)定的誘導(dǎo)條件[19]。本研究中17-β-雌二醇處理12 h后即可誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)水平達(dá)到最高，原因可能是恒定表達(dá)與瞬時表達(dá)方法不同導(dǎo)致的。本研究還發(fā)現(xiàn)，雌激素激活系統(tǒng)對GFP基因和對DME1基因的調(diào)控水平也有差異，可能是由于基因片段大小不同導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率的差異[20]。

植物中DNA甲基化以5—甲基胞嘧啶(5-methylcytisine)為主，DNA甲基化酶和去甲基化酶的協(xié)同作用維系甲基化模式和水平的相對穩(wěn)定。目前，在植物中對DNA主動去甲基化的調(diào)控機制已經(jīng)比較清楚[21]。然而DNA去甲基化酶的作用機理、生物學(xué)意義及其在表觀遺傳變異中發(fā)揮的作用仍需要更進(jìn)一步探索。由于DME1基因在雌蕊、胚乳中的表達(dá)量明顯高于其他組織[22]，說明該基因可能在植物的生殖發(fā)育中起作用。本研究成功構(gòu)建了DME1的化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)載體pER8-DME1，并采用煙草瞬時表達(dá)體系對其誘導(dǎo)表達(dá)特性進(jìn)行了研究，為深入DME1基因在研究植物基因組中的調(diào)控表達(dá)，特別是其在雌配子體發(fā)育過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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Constructing A Chemical-inducible Expression Vector ofAtDME1 and Its Transient Expression//

Chang Yingying, Gao Ya’nan, Liang Lixiong, Ding Changjun, Su Xiaohua, Zhang Bingyu

(Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation of State Forestry Administration, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(2)：75-79.

pER8-DME1； 17-β-estradiol； Chemical-inducible expression vector； Transient expression

常英英，女，1987年6月生，國家林業(yè)局林木培育重點實驗室(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所)，碩士研究生。E-mail:15510642172@163.com

張冰玉，國家林業(yè)局林木培育重點實驗室(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所)，研究員。E-mail:byzhang@caf.ac.cn。

2015年8月20日。

Q782

1)林木遺傳育種國家重點實驗室基本科研業(yè)務(wù)費專項資金課題(TGB2013010)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)課題(2013AA102703)。

責(zé)任編輯：潘華。