閆嵩　任偉超　劉振鵬　張開雪　馬偉　　　　劉秀波

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱，150040)　　　　　　　　　　(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院)

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黃芪中藥種衣劑對(duì)黃芪部分生理指標(biāo)的影響1)

閆嵩任偉超劉振鵬張開雪馬偉劉秀波

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱，150040)(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院)

黃芪為豆科植物膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge)或蒙古黃芪(A．membranaceus(Fisch.) Bunge var.mongholicus(Bunge) Hsiao)的干燥根。針對(duì)藥用植物黃芪的農(nóng)藝性狀和栽培中遇到的主要問題，開發(fā)制備了黃芪專用型種衣劑，對(duì)黃芪種子進(jìn)行包衣，通過田間試驗(yàn)，定期采樣，對(duì)黃芪的根系活力、葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硝態(tài)氮、蛋白質(zhì)、可溶性糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定，檢驗(yàn)種衣劑對(duì)黃芪的這5種生理指標(biāo)的影響。

黃芪；種衣劑；生理指標(biāo)

Astragalusis the dried root ofAstragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge orA.membranaceus(Fisch.) Bunge var.mongholicus(Bunge) Hsiao. To keep the agronomic traits and solve the main problems in cultivation, we successfully developed a seed-coating agent. We used seed coating agent to garment the seeds. By the field testing, we regularly sampled, and then respectively determined the root activity, chlorophyll content, nitrate nitrogen, protein, and soluble sugar, and examined the effects of seed coating agent on these physiological indexes.

黃芪藥材應(yīng)用在中國醫(yī)藥方面已有幾千年的歷史，是重要的傳統(tǒng)中藥材。黃芪的化學(xué)成分主要為多種三萜皂苷類、黃酮類和多糖等，黃芪總皂苷具有免疫調(diào)節(jié)、清除多種自由基的作用[1-3]，黃芪多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、強(qiáng)心降壓、降血糖、抗應(yīng)激、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗氧化等多種藥理功效[4]，黃酮類成分具有清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化和維持血中一氧化氮濃度，保護(hù)缺血再灌注損傷的作用[5]，黃芪的諸多藥用價(jià)值，使得黃芪的需求量極高，人工栽培的黃芪，在其生長發(fā)育過程中，仍存在很多問題，需要解決，比如，發(fā)芽率低、易產(chǎn)生病蟲害。種子包衣技術(shù)是國際上普遍使用的一種先進(jìn)種子處理技術(shù)，種衣劑以種子為載體包于種子表面，借助于成膜劑黏附在種子上，很快固化成為均勻的一層藥膜，不易脫落，播種后種衣劑對(duì)種子形成一個(gè)保護(hù)屏障，一次包衣，藥肥緩釋，具有增強(qiáng)種子活力、綜合防治苗期病、蟲害及缺素癥以及促進(jìn)作物的生長發(fā)育和促進(jìn)種子發(fā)芽的功能，同時(shí)種衣劑包衣相比藥劑拌種，省工省藥、成本低、操作簡(jiǎn)便、安全效果好，不易發(fā)生人畜中毒，可減輕環(huán)境污染，同時(shí)可節(jié)約種子，尤其是減少貴重種子的用量[6]。根據(jù)黃芪在生產(chǎn)中的實(shí)際問題，若研制出高效、低毒、環(huán)保的黃芪中藥種衣劑，則可以達(dá)到預(yù)防的作用。課題組研制出以蛇床子提取物為主要活性成分的種衣劑，并對(duì)黃芪種子進(jìn)行包衣處理，就種衣劑是否能促進(jìn)黃芪的生長發(fā)育進(jìn)行了初步的研究，以期獲得良好效果。

1　材料與方法

儀器：721型紫外可見分光光度計(jì)；離心機(jī)；水浴鍋(上海樹立儀器儀表有限公司)。

試劑：次甲基藍(lán)(天津市恒興化學(xué)試劑制作有限公司)；丙酮、無水乙醇(天津市富宇精細(xì)化學(xué)品有限公司)；水楊酸(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；硫酸(北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司)；氫氧化鈉，牛血清蛋白；考馬斯亮藍(lán)G-250(惠世生化試劑有限公司)；磷酸(天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司)；葡萄糖(天津市四通化工廠)。

黃芪品種為膜莢黃芪，黃芪中藥種衣劑自制。

將精選的黃芪種子，經(jīng)變溫處理12 h(41 ℃恒溫浸泡4 h，然后25 ℃保濕悶種8 h，中間經(jīng)常換水)后用吸水紙吸至表面無水，于室溫下風(fēng)干30 min，然后用黃芪種衣劑(m(種衣劑)∶m(種子質(zhì)量)=1∶50)進(jìn)行包衣，空白種子做對(duì)照(CK)，包衣完畢后進(jìn)行播種，行距45 cm，株距10 cm，田間管理同大田。于30、60、90、120和150 d取樣，并對(duì)其地下、地上部分進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，每次處理6株，試驗(yàn)3次重復(fù)。

根系活力的測(cè)定：將0.064 g·L-1的次甲基藍(lán)溶液分別倒入3個(gè)小燒杯中，編好號(hào)碼，每個(gè)燒杯中溶液的體積約10倍于根系的體積，準(zhǔn)確記下每個(gè)燒杯中的溶液量。取沖洗干凈的待測(cè)根系，用吸水紙小心吸干，慎勿傷根，然后按順序浸入盛有次甲基藍(lán)溶液的杯中，在每杯中浸1.5 min，注意每次取出時(shí)都要使次甲基藍(lán)溶液能從根上流回到原杯中去。從3個(gè)小燒杯中各吸取次甲基藍(lán)溶液1 mL，分別加到3支試管中，每管各加水9 mL，稀釋10倍，在660 nm波長下測(cè)定吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的濃度，最后算出每杯溶液中剩余甲烯藍(lán)的體積。

總吸收面積=(第1杯被吸收次甲基藍(lán)體積質(zhì)量杯被吸收次甲基藍(lán)體積質(zhì)量)×1.1 m2，

活躍吸收面積=(第3杯被吸收次甲基藍(lán)體積質(zhì)量)×1.1 m2。

葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定：參照崔勤[7]的方法并有所改動(dòng)，在試驗(yàn)田選取生長發(fā)育正常、無病蟲害的新鮮植株葉片，剪碎，準(zhǔn)確稱取0.1 g，加入等體積混合的丙酮—無水乙醇溶液10 mL，避光，室溫浸提12 h以上至葉片變白，于663、645 nm處測(cè)定樣品的吸光度值，并按下列公式計(jì)算葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

CT=Ca+Cb，

Ca=(12.7A663-2.59A645)×V/(m/1 000)，

Cb=(22.9A645-4.67A663)×V/(m/1 000)。

式中：Ca為葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù),Cb為葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)，CT為總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，V為提取液體積，m為樣品質(zhì)量。

硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)：取一定量的植物材料剪碎混勻，稱取(2～3)g/份，共3份，分別放入3支刻度試管中，加入10 mL無離子水，用玻璃泡封口，置于沸水浴中提取30 min。用自來水冷卻，將提取液過濾到25 mL容量瓶中，并反復(fù)沖洗殘?jiān)?，最后定容至刻度。吸取該樣品?.1 mL分別于3支刻度試管中，然后加入5%水楊酸—硫酸溶液0.4 mL，混勻后置室溫下20 min，再慢慢加入9.5 mL 8% NaOH溶液，待冷卻至室溫后，以空白作對(duì)照，在410 nm波長下測(cè)其吸光度。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得或用回歸方程計(jì)算出硝態(tài)氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再用以下公式計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

硝態(tài)氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)=C1V/W×100%。

式中：C1為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得或回歸方程計(jì)算得硝態(tài)氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；V為提取樣品液總量；W為樣品質(zhì)量。

蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)：稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50 mL 90%乙醇中，加入85%磷酸100 mL，最后用蒸餾水定容至1 000 mL，作為考馬斯亮藍(lán)G-250試液。取2 g黃芪樣品，剪碎，放入研缽中，加10 mL磷酸緩沖液，充分勻漿，將勻漿轉(zhuǎn)入離心管中，5 000 r·min-1離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中。用5 mL磷酸緩沖液懸浮沉淀，同上述操作，再提取兩次，上清液并入容量瓶中，用磷酸緩沖液定容至刻度，作為黃芪樣品提取液。吸取該樣品提取液0.1 mL，放入具塞刻度試管中(重復(fù)3次)，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試液，充分混合，放置2 min后在595 nm下比色，記錄吸光度值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。計(jì)算公式為：

式中:C2為查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得每管蛋白質(zhì)質(zhì)量(mg)；Vt為提取液總體積(mL)；V為測(cè)定所取提取液體積(mL)；W為取樣質(zhì)量(mg)。

可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)：稱取烘干、磨碎的黃芪一定部位葉片樣品0.15 g，置于刻度離心管中，加入7 mL 80%乙醇，于80 ℃水浴浸提并不時(shí)攪拌，提取30 min后冷卻，4 000 r·min-1離心5 min，沉淀再用80%乙醇重復(fù)提取2次，將3次提取的上清液合并于25 mL容量瓶中，以80%乙醇定容，供可溶性糖測(cè)定。準(zhǔn)確吸取可溶性糖的乙醇提取液1～2 mL，置于10 mL離心管中，于80 ℃水浴中蒸去乙醇，準(zhǔn)確加水至10 mL，用玻璃棒仔細(xì)攪拌，使糖完全溶解，離心，經(jīng)此處理可除去提取液中的色素。吸取上清夜2 mL，放入20 mL大試管中，其余操作與標(biāo)準(zhǔn)管相同，記錄620 nm波長下吸光度。計(jì)算公式如下：

式中：C3為查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得測(cè)定管葡萄糖的質(zhì)量(mg)；V為樣品中可溶性糖的提取液總體積(mL)；a為顯色時(shí)所取樣量(mL)；b為除色素時(shí)吸取提取液的量(mL)；W為樣品質(zhì)量(mg)。

2　結(jié)果與分析

2.1黃芪中藥種衣劑對(duì)黃芪根系活力的影響

制備1、2、3、4、5、6 mg·L-1次烯藍(lán)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，于660 nm處測(cè)定吸光度，以次甲基藍(lán)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為y=183.04x+0.014，r=0.997 2。由表1可以看出，根系的總吸收面積呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，在播后90 d包衣組比對(duì)照組增幅明顯，可達(dá)21.69%；由表2可知，包衣組的根系活躍吸收面積呈現(xiàn)先升高、降低、再升高的趨勢(shì)，而對(duì)照組則是先升高再降低。

表1　黃芪根系不同播種時(shí)間總吸收面積的動(dòng)態(tài)變化

表2　黃芪根系不同播種時(shí)間活躍吸收面積的動(dòng)態(tài)變化

2.2黃芪中藥種衣劑對(duì)黃芪葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

如表3、4、5所示，葉綠素a和葉綠素b均呈現(xiàn)先升高后降低、然后再升高、降低的態(tài)勢(shì)，且包衣組和對(duì)照組的變化趨勢(shì)基本一致，包衣組比對(duì)照組葉綠素a的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加，但葉綠素b的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在果熟期比對(duì)照低，總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在60 d時(shí)包衣組比對(duì)照組漲幅明顯，為29.81%。

表3　黃芪葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)的動(dòng)態(tài)變化

表4　黃芪葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)的動(dòng)態(tài)變化

表5　黃芪總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的動(dòng)態(tài)變化

2.3黃芪中藥種衣劑對(duì)黃芪硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由表6可知，包衣組的黃芪在8月份硝態(tài)氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，比對(duì)照組增加69.94%，而在7月和9月均與對(duì)照組相當(dāng)，表明運(yùn)用黃芪中藥種衣劑在果熟期可以促進(jìn)根系對(duì)土壤中氮素的吸收能力，為植物生長提供能量。

表6　黃芪硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的動(dòng)態(tài)變化

2.4黃芪中藥種衣劑對(duì)黃芪蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

考馬斯亮藍(lán)G-250在游離態(tài)下呈紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，前者最大吸光度?65 nm，后者在595 nm。在一定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(0～100 mg·L-1)，蛋白質(zhì)色素結(jié)合物在595 nm波長下的吸光度與蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正比。表7表明，包衣組的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)直線上升的趨勢(shì)，且在9月增幅明顯，為27.46%。

表7　黃芪蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的動(dòng)態(tài)變化

2.5黃芪中藥種衣劑對(duì)黃芪可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

植物體內(nèi)的可溶性糖是光和作用的產(chǎn)物，可以評(píng)價(jià)植物的營養(yǎng)狀況。表8表明，包衣組和對(duì)照組的可溶性糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，且包衣組可溶性糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對(duì)照組略高。

表8　黃芪可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的動(dòng)態(tài)變化

3　結(jié)論與討論

植物根系是吸收水分和礦質(zhì)營養(yǎng)的主要器官，同時(shí)也是體內(nèi)許多重要有機(jī)物(包括某些生理活性物質(zhì))合成的場(chǎng)所，根系與地上部分正常的物質(zhì)交流和循環(huán)，是植物正常生長的重要保證[8]，所以研究根系活力并促進(jìn)黃芪根系發(fā)育是非常必要的，因?yàn)楦祷盍δ芊从吵龈滴账趾蜖I養(yǎng)物質(zhì)的能力，通過研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用黃芪中藥種衣劑可以明顯提高黃芪果熟期的根系活力，黃芪中藥種衣劑可能是通過提高黃芪根系吸收水分和礦質(zhì)營養(yǎng)能力，加強(qiáng)呼吸作用，從而為根系的發(fā)育和地上的生長提供了充足的物質(zhì)與能量。

光合色素是植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，是衡量作物農(nóng)藝性狀優(yōu)劣的依據(jù)之一，其中葉綠素a、b是捕光色素，一般情況下，捕光色素越豐富，捕捉的光能越多，利用光能還原CO2產(chǎn)生的有機(jī)物(主要是糖類物質(zhì))就越大，這樣就有利于組織細(xì)胞的建成[9]。對(duì)于葉綠素a而言，黃芪中藥種衣劑促進(jìn)作用明顯，而對(duì)于葉綠素b則促進(jìn)作用不明顯，說明黃芪種衣劑主要是通過影響葉綠素a的質(zhì)量分?jǐn)?shù)而促進(jìn)總?cè)~綠素增加的。

葉片中硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)直接反應(yīng)植物體內(nèi)硝態(tài)氮累積與代謝情況，是植物的氮素營養(yǎng)、氮素同化利用狀況的重要指標(biāo)，植物體內(nèi)硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以反映土壤氮素供應(yīng)情況，常用作為施肥指標(biāo)[10]。本次研究結(jié)果顯示，黃芪中藥種衣劑可以提高黃芪根系對(duì)土壤中氮素的吸收能力。

蛋白質(zhì)不僅是生物有機(jī)體的重要組成部分，而且作為生物催化反應(yīng)的酶類，在各種生理功能中起重要作用[11]。運(yùn)用黃芪中藥種衣劑可以持續(xù)增加黃芪中的蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，提高物質(zhì)的代謝能力。

糖類是植物光合作用的重要產(chǎn)物，它依靠呼吸作用為植物的生命活動(dòng)、信息傳遞、形態(tài)建成和逆境防御等生理活動(dòng)提供能量與原料。試驗(yàn)結(jié)果表明，運(yùn)用黃芪中藥種衣劑可以在一定程度上提高黃芪可溶性糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

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Effect of Seed Coating Agent by Chinese Medicine onAstragalusPhysiological Indexes//

Yan Song, Ren Weichao, Liu Zhenpeng, Zhang Kaixue, Ma Wei

(Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, P. R. China); Liu Xiubo(Jiamusi College, Heilongjiang University of Chinese Medicine)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(2)：11-14.

Astragalusmongholicus; Seed coating agent; Physiological index

閆嵩，男，1989年9月生，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，碩士研究生。E-mail:394576931@qq.com。

劉秀波，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，副教授。E-mail:358270831@qq.com。

2015年9月11日。

R927.2

1)林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201004079，201404718)；國家自然科學(xué)基金(81274010)；黑龍江省杰出青年基金(JC201101)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)“優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計(jì)劃”項(xiàng)目。

責(zé)任編輯：潘華。