薛智權(quán)++呂蕊++李宏++呂建華

摘 要：富油微藻在生物柴油應(yīng)用方面具有良好的應(yīng)用前景，分析其脂肪酸的含量和成分對(duì)其有效利用具有理論指導(dǎo)意義。采用擴(kuò)增18S rRNA片段對(duì)本試驗(yàn)所分離得到的一株富油微藻進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并分別用50%，65%和80%三種不同濃度的甲醇、乙醇和丙酮溶液作為溶劑，采用索式提取法抽提藻油，然后采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）分析藻油中脂肪酸的含量及成分，并確定最佳的提取方案。結(jié)果表明，18S rRNA序列顯示，該微藻屬于角毛藻Chaetoceros dichaeta。有機(jī)溶劑抽提藻油時(shí)，50%甲醇的抽提效果最佳，提取效果隨甲醇濃度增加而降低。乙醇的提取效果跟甲醇類(lèi)似，而丙酮的提取效果隨濃度提高有所改善，但總體效率不高。在最佳提取條件下，藻油產(chǎn)率達(dá)到了451.6 mg·g-1干藻。該角毛藻油中脂肪酸主要為飽和的14碳和16碳長(zhǎng)鏈脂肪酸，含量分別為23.96%和68.58%。研究認(rèn)為：該微藻屬于角毛藻類(lèi)，甲醇為比較適合的提取該微藻藻油的溶劑；該角毛藻富含長(zhǎng)鏈脂肪酸，在生物柴油等綠色能源行業(yè)具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：角毛藻；索式提??； 藻油；氣質(zhì)聯(lián)用色譜分析（GC-MS）

中圖分類(lèi)號(hào)：S968.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.08.001

Abstract： In order to analyze the content and composition of fatty acids in an oil-riching microalgae with good application prospect， the 18S rRNA gene of the isolated oil-rich microalgae was amplified for molecular biology identification. 50%， 65% and 80% of methanol， ethanol and acetone solution， respectively， was used as solvent for soxhlet extraction algal oil. Gas chromatography - mass spectrometry （GC-MS） was combined to analysis the content and composition of fatty acids in algae oil， and to determine the best extraction scheme. The results showed that 18S rRNA sequences showed that the microalgae belonged to Chaetoceros dichaeta. When the algae oil was extracted with organic solvent， the extraction efficiency of 50% methanol was the best， and the extraction efficiency decreased with the increase of methanol concentration. The extraction effect of ethanol was similar to that of methanol， and the extraction effect of acetone was improved with the increase of concentration， but the overall efficiency was not high. Under the optimum extraction conditions， the algae oil yield reached 451.6 mg·g-1 dry weight. The main fatty acids were 14 and 16 carbon saturated long chain fatty acids， with the ratio of 23.96% and 68.58%， respectively. The microalgae belongs to Chaetoceros dichaeta. Methanol is more suitable for the extraction of the microalgae oil. This microalgae has good application value in biodiesel because of its rich in long chain fatty acids.

Key words：Chaetoceros； soxhlet extraction； algae oil； gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）

近年來(lái)，隨著化石燃料日益減少，可再生的生物柴油備受關(guān)注。生物柴油的基本成分為脂肪酸酯，主要是通過(guò)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)將甘油三酯或游離脂肪酸跟低級(jí)醇類(lèi)反應(yīng)而得。早期用于合成生物柴油的原料為大豆、油菜、葵花籽、玉米等油料作物[1-4]，但是這些可食用油成本太高。后來(lái)也有采用廢棄食用油如動(dòng)物油脂或烹飪后的植物油為原料的[5-9]，然而受限于供應(yīng)量，不能大規(guī)模應(yīng)用。目前，各國(guó)普遍采用棕櫚樹(shù)、麻風(fēng)樹(shù)、可可樹(shù)、棉籽、亞麻薺等非食用油料作物[10-15]，我國(guó)境內(nèi)富含油脂的黃連木[16]、冠果[17]、毛梾樹(shù)[18]等大型木本作物也廣受關(guān)注。然而，木本作物生長(zhǎng)緩慢，生物轉(zhuǎn)化效率低，導(dǎo)致目前生物柴油的價(jià)格居高不下，難以普及應(yīng)用。因此，含油量高、生物量大、易于培養(yǎng)且生物轉(zhuǎn)化效率高的富油微藻成為研究者的新寵，也被看成是最有可能替代化石燃料的可再生油料資源，目前在藻類(lèi)種質(zhì)資源發(fā)掘、培養(yǎng)條件優(yōu)化、成熟藻回收及生物柴油轉(zhuǎn)化等環(huán)節(jié)均成為了研究熱點(diǎn)[19-21]。

微藻為單細(xì)胞的浮游藻類(lèi)，能在淡水或咸水里生長(zhǎng)，具有良好的抗逆性，目前通常在邊際土上培養(yǎng)，不會(huì)占用產(chǎn)糧耕地。微藻的生長(zhǎng)非常迅速，每天可提升一倍的生物量，在指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)的倍增時(shí)間會(huì)縮短到不到4 h，單位面積下微藻年產(chǎn)量比目前產(chǎn)量最高的油料作物還要高7～23倍[22-23]。早期人們關(guān)注微藻是因?yàn)槎喾N微藻含有大量的多不飽和脂肪酸，包括二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA），均具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[24-25]。后來(lái)發(fā)現(xiàn)有些微藻所合成的長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸占據(jù)絕大比例，為合成生物柴油的絕佳原料，在生物能源方面也具有良好的應(yīng)用前景[26]。

本試驗(yàn)組在前期的工作中，從深圳灣紅樹(shù)林的沉積土壤中分離得到了一株生長(zhǎng)迅速的富油微藻SXAU-SK-M04，經(jīng)鑒定為角毛藻Chaetoceros sp.。本試驗(yàn)擬采用不同的有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇和丙酮），用索式提取的方法提取其中的油脂，然后采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）檢測(cè)藻油中脂肪酸的成分及含量，測(cè)定該角毛藻所含脂肪酸的種類(lèi)及含量，并確定適宜的提取方法，可為闡明該品種角毛藻的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，進(jìn)一步大規(guī)模培養(yǎng)和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 藻 種 富油微藻藻種，由本研究組前期從深圳灣紅樹(shù)林海水中分離培養(yǎng)獲得，保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基組成 海水培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨1.5 g，酵母提取物0.5 g，海水鹽精15個(gè)，用蒸餾水溶解并定容到1 000 mL，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 擴(kuò)增引物 利用真核生物18S rRNA通用引物18SF：5-AACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3和18SR：5-CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT-3，由北京華大基因研究中心合成。

1.1.4 主要試劑 甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純，土壤微生物基因組提取試劑盒和2×Pfu MasterMix PCR反應(yīng)試劑盒均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 分子鑒定 取保存的藻種，接種于5 mL海水培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d，吸取1 mL菌液，按照DNA提取試劑盒的說(shuō)明操作。所提取的基因組DNA溶解于30 μL蒸餾水中，取3 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取基因組DNA的濃度和完整性。然后用基因組DNA為模板，18SF和18SR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL反應(yīng)體系含有2×Pfu MasterMix 25 μL，基因組DNA 2 μL，18SF 1 μL，18SR 1 μL，滅菌雙蒸水21 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，接著72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物3 μL用1%瓊脂糖電泳鑒定后，直接將PCR產(chǎn)物送到華大基因研究中心進(jìn)行測(cè)序分析。將返回的測(cè)序結(jié)果登入GenBank進(jìn)行比對(duì)，以確定微藻的種屬。

1.2.2 微藻大量擴(kuò)增 將前面的微藻發(fā)酵液按照5%接種量接種于大體積培養(yǎng)瓶中進(jìn)行放大培養(yǎng)，總體積達(dá)到1 L。28 ℃ 180 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，將發(fā)酵液6 000 r·min-1離心10 min，收集藻泥，用蒸餾水清洗兩次，然后將所得藻泥置于65 ℃烤箱中干燥至恒質(zhì)量。

1.2.3 藻油提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取干藻粉5.00 g，用濾紙包好，放入索氏提取器中，分別用50%，65%，80%（V/V）的甲醇、乙醇和丙酮水溶液進(jìn)行抽提，水浴加熱的溫度為60 ℃。直至回流的液體呈無(wú)色為止，每個(gè)樣品抽提時(shí)間大約3 h。然后將提取液置于圓底燒瓶中，65 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮，待溶液體積到5 mL左右，收集濃縮液，用異丙醇稀釋定容到50 mL。采用0.22 μm超濾膜過(guò)濾后，準(zhǔn)備用于下一步試驗(yàn)。

1.2.4 藻油成分及含量檢測(cè) 取1 mL過(guò)濾后的藻油，置于氣相色譜樣品管中，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合分析儀（氣相色譜儀為T(mén)race1300，質(zhì)譜儀為T(mén)race ISQ，Thermo Fisher，USA）進(jìn)行分析。色譜柱為DB-5ms毛細(xì)管柱（35 m×250 μm×0.25 μm），掃描荷質(zhì)比范圍為40～500。載氣為He，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度280 ℃。升溫條件為：初始溫度70 ℃ 2 min，然后以10 ℃·min-1升溫到220 ℃，接著以3 ℃·min-1升溫到260 ℃，然后以10 ℃·min-1升溫到280 ℃，保持5 min。以37種混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（NU-CHEK-PREP，INC.，USA）為參照。通過(guò)比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品并計(jì)算峰面積，確定各組分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 微藻的鑒定

采用試劑盒提取基因組DNA和擴(kuò)增微藻的18S rRNA片段，瓊脂糖電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1-A為基因組DNA的電泳圖，可以看出所提取的基因組DNA濃度和完整性均比較好，可用于進(jìn)行基因片段的擴(kuò)增。圖1-B為18S rRNA片段擴(kuò)增結(jié)果，可以看到有一條大約2 000 bp大小的DNA擴(kuò)增片段，產(chǎn)物單一，純度很好。

對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，得到一條長(zhǎng)度為1 884 bp的序列結(jié)果。將該序列上傳到GenBank，序列號(hào)為KX276168。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并選取近似的物種序列，構(gòu)建Neighbor-Joining Tree進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

從進(jìn)化樹(shù)分析可知，該微藻跟Chaetoceros dichaeta的18S rRNA（GenBank ID：KF925340.1）有99%的相似性，故將該微藻命名為Chaetoceros dichaeta SXAU-SK-M04。

2.2 微藻大量培養(yǎng)

在配制的海水培養(yǎng)基中，按照5%接種量，28 ℃ 180 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，收集藻泥并烘干，1 L發(fā)酵液得到的干藻粉平均為12.8 g。在該培養(yǎng)條件下，該微藻的生物量日積累速度達(dá)到了1.8 g·L-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道的纖細(xì)角毛藻的0.86 g·L-1生物量和牟氏角毛藻的不到0.7 g·L-1 [27-29]。

2.3 藻油成分及含量分析

采用不同濃度的甲醇、乙醇和丙酮為溶劑，提取微藻藻油，然后經(jīng)GC-MS分析，將質(zhì)譜圖跟脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品比較，確定藻油中所含脂肪酸的成分。3種溶劑提取的藻油氣相圖譜比較見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，藻油中脂肪酸種類(lèi)主要為14～18個(gè)碳原子的長(zhǎng)鏈脂肪酸，出峰時(shí)間集中在第15分鐘到20分鐘之間。以37中脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品為參照，并經(jīng)質(zhì)譜庫(kù)比對(duì)，確定圖中的峰1～6分別為C14∶0、C15∶0、C16∶1、C16∶0、C18∶1和C18∶0。

以標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為參照，計(jì)算藻油各成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

結(jié)合圖3和表1 的數(shù)據(jù)，很容易看出，甲醇和乙醇的提取物脂肪酸成分很類(lèi)似，提取效果均是隨醇濃度增加而降低，其中以50%甲醇溶液所提取的藻油量最大，達(dá)到了45.16 mg·mL-1，折合藻油含量為451.6 mg·g-1干藻粉。而采用丙酮溶液提取的效果則差了很多，雖然隨丙酮濃度增加藻油產(chǎn)率有所增加，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能跟甲醇的提取效果相比較。丙酮提取物中18個(gè)碳原子的脂肪酸含量很少，基本上不能檢出，而更短鏈的脂肪酸含量也顯著低于甲醇和乙醇提取液中的含量。分析其原因可能是醇類(lèi)的極性要比酮類(lèi)大，比較容易進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部，導(dǎo)致微藻細(xì)胞內(nèi)的脂類(lèi)釋放量更加完全。根據(jù)相同的理由，推斷甲醇的提取效果會(huì)好于乙醇，跟試驗(yàn)結(jié)果相吻合。綜合比較，50%甲醇溶液的提取效果為最佳。

通過(guò)對(duì)該角毛藻的藻油成分分析可知，藻油中主要成分為C14∶0和C16兩大類(lèi)中短鏈脂肪酸，含量分別占到了總量的23.96%和68.58%。這種脂肪酸構(gòu)成比，使這類(lèi)藻油非常適合于生產(chǎn)生物柴油。干粉中含油量45%雖然不是最高，考慮到該種角毛藻生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)條件適應(yīng)性廣，且培養(yǎng)成本低廉，提示該種微藻在生物柴油生產(chǎn)方面具有非常重要的應(yīng)用前景。

3 結(jié) 論

本研究采用18S rRNA片段對(duì)前期分離得到的富油微藻進(jìn)行分子鑒定，確定其為Chaetoceros dichaeta SXAU-SK-M04。通過(guò)有機(jī)溶劑索氏提取角毛藻藻油，并采用GC-MS分析所得藻油的含量及成分，一方面確定了最佳提取試劑為50%甲醇溶液，另一方面也明確了該種角毛藻中脂肪酸的構(gòu)成比，為進(jìn)一步大規(guī)模利用藻油提供了理論依據(jù)。

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