王恩花，楊禮壽，逯鳳肖，秦　湉，秦澤華，郁建平

(貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

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二氫楊梅素體外抗氧化活性研究

王恩花，楊禮壽，逯鳳肖，秦湉，秦澤華，郁建平*

(貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

二氫楊梅素；體外抗氧化活性；自由基；總抗氧化活性

二氫楊梅素(Dihydromyricetin，DMY)為藤茶的主要功效成分，又名蛇葡萄素、白蘞素、福建茶素等[1]。DMY 屬于黃酮類化合物，研究表明其毒性小，有優(yōu)良的抑菌、護(hù)肝和抗癌等作用，可清除氧自由基，抑制自由基對(duì)人體組織器官的損害，具有很大的開發(fā)應(yīng)用前景[2]。由于一些合成抗氧化劑，如二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)被發(fā)現(xiàn)有不同程度的致癌等毒副作用，因而在美國(guó)和日本已停止使用[3]。隨著天然食品添加劑的開發(fā)，開發(fā)抗氧化活性好、毒性小的天然食品添加劑已成為研究熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)葡萄科蛇葡萄屬植物中大量存在DMY，且在顯齒蛇葡萄中其含量極高，這使得DMY開發(fā)為食品抗氧化劑成為可能[4]。本研究采用改良的DPPH對(duì)照法測(cè)定DMY對(duì)DPPH的體外清除率，羥自由基、超氧陰離子體外清除能力、體外總抗氧化能力則是采用快速簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、再現(xiàn)性好的試劑盒方法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定四個(gè)抗氧化性指標(biāo)，較全面地對(duì)DMY進(jìn)行抗氧化功能評(píng)價(jià)，為DMY在食品方面的開發(fā)應(yīng)用提供進(jìn)一步的參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

由貴州大學(xué)生化營(yíng)養(yǎng)研究所植化實(shí)驗(yàn)室提取的二氫楊梅素(DMY)。

1.2試劑

冰乙酸、無水乙醇、抗壞血酸(Vc)硫酸亞鐵，水楊酸，griess試劑，gress氏試劑，氫氧化鈉，三氯化鐵，過氧化氫，菲啉試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)購(gòu)買于河南千志商貿(mào)有限公司；對(duì)二苯基苦基肼自由基(DPPH)購(gòu)買于阿拉?。涣u自由基測(cè)試盒、抗超氧陰離子測(cè)試盒、總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)試盒購(gòu)買于南京建成生物工程研究所。

1.3儀器與設(shè)備

ISO9001型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司)，KX-1740QTD型超聲波清洗儀(北京科璽世紀(jì)科技有限公司)，TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)，GZE-9140 mBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠)，XK96-A型快速漩渦混勻器(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)等。

1.4對(duì) DPPH· 的清除測(cè)定

二苯代苦味肼基自由基(DPPH)能穩(wěn)定存在于機(jī)溶劑中，不溶于水，在乙醇溶液中呈典型的紫色，并在517 nm處有最大吸收[5]。加入抗氧化劑時(shí)，抗氧化劑一個(gè)電子與DPPH分子中穩(wěn)定的自由基配對(duì)，溶液的顏色由深紫色向黃色轉(zhuǎn)變，其褪色程度與抗氧化劑清除自由基的能力有關(guān)。由于DPPH 檢測(cè)法具有簡(jiǎn)便易行、靈敏可靠、不需要昂貴的儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于自由基清除劑的篩選和研究工作中[6]。

DPPH 溶液的配制：稱取 DPPH 0.0201 g于100 mL燒杯中，加10 mL無水乙醇，超聲5 min，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶，定容，得到摩爾濃度為0.2039 mmol/L，避光保存，3 h 之內(nèi)用完。

取2.0 mL濃度分別為5.0、7.5、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0 mg/mL的DMY溶液和TBHQ溶液放置于試管中，各加入2.0 mL濃度為0.2039 mmol/L 的DPPH 溶液，在25℃水浴中避光反應(yīng)30 min，用分光光度計(jì)在517 nm下測(cè)定吸光度值(A1)；取2.0 mL不同和濃度的溶液加入2.0 mL的無水乙醇，測(cè)定樣品吸光度(A2)；取2.0 mL蒸餾水加入2.0 mL DPPH溶液測(cè)得空白吸光度(A3)。以濃度分別為5.0、7.5、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0 mg/mL 的Vc溶液為陽性對(duì)照。DPPH 清除率越高其抗氧化能力越強(qiáng)。

清除能力公式為：清除率(%)=[1-(A1- A2)/ A3]×100%

1.5對(duì)·OH的清除測(cè)定

生命代謝過程中會(huì)不斷產(chǎn)生活性氧，羥基自由基為最活躍的活性氧，是高反應(yīng)自由基，毒害大，能夠激發(fā)油脂過氧化反應(yīng)，因此在植物抗氧化性能力檢測(cè)時(shí)有必要對(duì)羥基自由基清除能力進(jìn)行檢測(cè)[7-8]。羥基自由基檢測(cè)法原理是H2O2和Fe2 +混合后，生成具有很高反應(yīng)活性、能與水楊酸結(jié)合產(chǎn)生顏色，在550 nm處有強(qiáng)吸收，羥基自由基清除物質(zhì)可與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)，從而使得有色物質(zhì)減少，通過比色法測(cè)定待測(cè)物的清除能力[9]。具體操作按照試劑盒說明進(jìn)行。

取濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的DMY溶液和TBHQ溶液按說明書制備反應(yīng)體系(見表1)，混勻，放置20 min，波長(zhǎng)550 nm，測(cè)定各管吸光度值。以濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的Vc溶液為陽性對(duì)照，平行測(cè)定三次，取平均值。

表1　清除羥自由基反應(yīng)體系

注：抑制羥自由基能力的計(jì)算：抑制羥自由基能力(U/mL)=(對(duì)照OD值-測(cè)定OD值)÷(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×44.12

反應(yīng)體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基，加入電子傳遞物質(zhì)及gress氏顯色劑，使反應(yīng)體系呈紫紅色，體系含有超氧陰離子自由基抑制劑時(shí)，比色時(shí)測(cè)定管的吸光度低于對(duì)照管的吸光度。具體操作按照試劑盒說明進(jìn)行。

分別取濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL的DMY溶液和TBHQ溶液按試劑盒說明書制備反應(yīng)體系(見表2)，混勻，放置10 min，550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管吸光度值。以濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL的Vc溶液為陽性對(duì)照，平行測(cè)定三次，取平均值。

表2　抗超氧陰離子自由基反應(yīng)體系

注：抗超氧陰離子活力計(jì)算：抗超氧陰離子活力單位(U/L)=(對(duì)照OD值-測(cè)定OD值)/(對(duì)照OD值-標(biāo)準(zhǔn)OD值)×150

1.7總抗氧化能力測(cè)定

體系中的抗氧化物質(zhì)，能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉試劑形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，通過比色可測(cè)出其抗氧化能力的高低。具體操作按照試劑盒說明進(jìn)行。

取濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL的 DMY溶液和TBHQ溶液按說明書制備反應(yīng)體系(見表3)，混勻，放置10 min，520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各管吸光度值。以濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL的VC溶液為陽性對(duì)照，平行測(cè)定三次，取平均值。注意每個(gè)濃度都要測(cè)對(duì)照管。

表3　總抗氧化能力反應(yīng)體系

注：總抗氧化能力計(jì)算公式：總抗氧化能力(單位/毫升溶液)=(測(cè)定OD值-對(duì)照OD值)÷0.3×37

2　結(jié)果與討論

2.1對(duì) DPPH 自由基的清除能力

不同Vc、DMY 和TBHQ濃度對(duì)DPPH清除能力的影響，見表4和圖1。

從圖1可以看出，DMY、TBHQ在5～20 mg/mL試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)時(shí)，其對(duì)DPPH的清除能力與濃度呈正相關(guān)，當(dāng)Vc、DMY、TBHQ濃度為20 mg/mL 時(shí)，清除率分別為76.91%、91.79%、90.74%，DMY組與Vc組對(duì)自由基清除率具有極顯著差異(P< 0.01)，再增加DMY、TBHQ的含量對(duì)自由基清除率增大不明顯；常用抗氧劑VC對(duì)DPPH的清除作用隨Vc 濃度(5～30 mg/ mL)的增加而增大，當(dāng)含量達(dá)到30 mg/mL 時(shí)，清除率為95.25%，再增加Vc的含量對(duì)自由基清除率增大不明顯。結(jié)果表明，DMY表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH清除能力，濃度為20 mg/mL 清除率(91.79%)達(dá)最大值，與同濃度下Vc清除率(76.91%)有極顯著差異(P< 0.01)；當(dāng)試驗(yàn)濃度為30 mg/mL 時(shí)，DMY組清除率大最大值為94.25%，Vc組也達(dá)最大清除率95.25%，兩組沒有顯著性差異(P> 0.05),濃度再增加清除率變化不明顯。由此可見，當(dāng)試驗(yàn)濃度較低(5～20 mg/mL)時(shí)，DMY對(duì)清除DPPH的清除能力優(yōu)于Vc，當(dāng)Vc、DMY、TBHQ濃度為30～60mg/mL范圍時(shí)，DPPH自由基清除率變化不大。

Tab.4DPPH· scavenging activities on Vc,

濃度(mg/mL)DPPH清除率(%)DMYVcTBHQ535.86±0.2aA19.83±0.09B34.81±1.37aA7.551.53±0.14aA29.42±0.14B52.69±0.83aA1061.41±0.04aA38.73±0.17B62.69±0.32aA2091.79±0.14aA76.91±2.82B90.74±0.28aA3094.25±0.15a95.25±0.3a91.76±0.22b4093.43±0.06b97.23±0.14a93.98±0.24b5093.89±0.12b97.3±0.09a91.76±0.29c6093.8±0.07b97.39±0.14a92.13±0.13b

注:同行小寫字母不同表示有顯著差異(P<0.05)，同行大寫字母不同表示有極顯著差異(P< 0.01)， 下同。

圖1　VC、DMY 和TBHQ對(duì) DPPH清除能力

2.2對(duì)羥基自由基(·OH)的清除能力

不同DMY、TBHQ和Vc濃度對(duì)羥基自由基清除能力的影響，見表5和圖2。

采用Fenton 反應(yīng)，對(duì)DMY清除羥自由基能力進(jìn)行測(cè)定，從圖2可以看出，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，清除率隨著清除劑含量的增加而逐漸增大，三種清除劑對(duì)羥基自由基都表現(xiàn)出一定程度的清除能力，試驗(yàn)濃度為6 mg/mL時(shí)，Vc、TBHQ、DMY的清除能力分別達(dá)到617.49 U/mL、513.84% U/mL、495.09 U/mL，DMY組與Vc組有極顯著差異(P< 0.01)，與TBHQ組有顯著差異(P< 0.05)。比較發(fā)，相同濃度下對(duì)羥基自由基清除能力 Vc > TBHQ > DMY，說明DMY對(duì)羥基自由基的清除效果要差一些。

表5DMY、TBHQ和Vc對(duì)羥基自由基清除能力

Tab.5　·OH inhibiting activities on Vc,

濃度(mg/mL)清除羥自由基能力(U/mL)DMYVcTBHQ0.01135.19±0.73bB392.79±1.19A152.51±0.68bB0.02252.11±1.00bB438.46±1.32A272.21±1.26bB0.03350.77±1.22bB474.99±1.28A374.52±0.84bB0.04354.42±1.64cB569.99±1.60A449.42±0.39bB0.05469.52±1.22cB571.82±0.63A500.57±0.73bB0.06495.09±2.31bB617.49±0.84A513.84±2.61bB

圖2　DMY、TBHQ和Vc對(duì)羥基自由基清除能力

不同DMY、TBHQ濃度對(duì)超氧陰離子清除能力的影響，見表6和圖3。

從圖3可以看出，試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，DMY、TBHQ對(duì)超氧陰離子的清除能力均與其含量呈量效關(guān)系，隨著超氧陰離子清除劑含量增加其清除能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)試驗(yàn)濃度為0.30 mg/mL 時(shí)，DMY、TBHQ的清除能力達(dá)到182.61 U/L、186.26 U/L，DMY組與TBHQ相比具有顯著性(P< 0.05)。從總體趨勢(shì)來看，二者對(duì)超氧陰離子的清除能力相當(dāng)。

濃度(mg/mL)超氧陰離子自由基(U/L)DMYTBHQ0.05124.81±0.55b128.24±0.86a0.10146.56±0.83A135.88±0.56B0.15157.25±0.94b160.31±0.48a0.20161.83±0.27B171.76±0.29A0.25173.66±0.84b175.95±0.32a0.30186.26±1.08a182.61±1.64b

圖3　DMY、TBHQ對(duì)超氧陰離子清除能力

2.4總抗氧化能力的測(cè)定

不同DMY、Vc和TBHQ濃度對(duì)總抗氧化能力的影響，見表7和圖4。

表7　DMY、Vc和TBHQ總抗氧化能力

從圖4可以看出，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，DMY、Vc 和TBHQ都表現(xiàn)出一定程度的抗氧化活性，并且呈明顯量效關(guān)系，DMY、Vc的總抗氧化效果要好于TBHQ，在濃度為0.30 mg/mL 時(shí)，DMY、Vc、TBHQ的總抗氧化能力分別為0.309 U/mL、0.313 U/mL、0.301 U/mL，DMY組較Vc組差異不顯著(P> 0.05)，DMY組較TBHQ組差異顯著(P< 0.05)。

圖4　DMY、Vc和TBHQ總抗氧化能力

3　結(jié)　論

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·研究簡(jiǎn)報(bào)·

Study on Antioxidant Activity of DihydromyricetininVitro

WANGEn-hua,YANGLi-shou,LUFeng-xiao,QINTian,QINZe-hua,YUJian-ping*

(CollegeofPharmacy,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

Dihydromyricetin; Antioxidant activityinvitro; Free radical; Total antioxidant activity

1008-0457(2016)03-0086-05國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.03.017

2016-03-18；修回日期：2016-04-15

貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目“貴州省藤茶資源及深加工研究與應(yīng)用”([黔科合NY[2011]3094 號(hào))。

郁建平(1956-)，男，博士，主要研究方向：食品化學(xué)、天然藥物化學(xué)、生化分離工程及農(nóng)副產(chǎn)品的開發(fā)及利用；E-mail: yujp666666@ 163.com。

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