史先花，張峻嶺，康元（.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，濟(jì)寧 7000；.天津中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 000；.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 009）

葡萄籽原花青素及UVA照射對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響

史先花1，張峻嶺2，康元3
（1.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，濟(jì)寧 272000；2.天津中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

目的觀察葡萄籽原花青素（GSPE）和長(zhǎng)波紫外線（UVA）對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）增殖的影響，以探討GSPE有無(wú)光保護(hù)作用。方法MTT法分別測(cè)定不同濃度GSPE以及不同劑量UVA對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果 GSPE濃度為5～200 μg/mL時(shí)，對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖影響不明顯，濃度為500 μg/mL及以上時(shí)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；UVA劑量超過(guò)10 J/cm2有抑制作用且隨劑量增高抑制作用越明顯，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，25 J/cm2時(shí)其抑制率達(dá)37.65%；濃度為50、100 μg/mL的GSPE對(duì)25 J/cm2UVA照射后的HaCaT細(xì)胞的增殖有明顯促進(jìn)作用。結(jié)論25 J/cm2的UVA對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，而合適濃度的GSPE對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性有光保護(hù)作用。

葡萄籽原花青素；長(zhǎng)波紫外線；人角質(zhì)形成細(xì)胞

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料DMEM高糖液態(tài)培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶、D-Hank's液和MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢驗(yàn)試劑盒，GSPE為天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司贈(zèng)送。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與UVA照射將HaCaT細(xì)胞以密度為105/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)和傳代，當(dāng)細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、密度近1×106/mL（融合度近80%）時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。光源為UVA光療儀SS-03A，波長(zhǎng)320～400 nm。光源至細(xì)胞的照射距離為15 cm。

1.3不同濃度GSPE的配制稱取一定量的GSPE融于二甲基亞砜溶液（DMSO）中制成50 mg/mL的母液，-20℃保存，臨用時(shí)用新鮮培養(yǎng)基調(diào)至終濃度。1.4實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)設(shè)調(diào)零孔（MTT液+DMSO）即空白對(duì)照組，光照組（5，8，10，15，20，25，30，40 J/cm2），藥物組（5、10、25、50、75、100、200、500 μg/mL），照光25 J/cm2加藥（10，50，100 μg/mL）組。每個(gè)劑量或濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞消化，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種密度為4×103/孔，液體量200 μL/孔，過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁，吸去培養(yǎng)液，用D-Hank's液沖洗、換液，對(duì)細(xì)胞分別進(jìn)行不同劑量紫外線照射、不同濃度GSPE處理，添加培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，對(duì)照組不照光僅加入含等量溶媒的培養(yǎng)基。處理結(jié)束時(shí)，每孔加5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)置CO2孵箱培養(yǎng)4 h，然后吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，充分振搖培養(yǎng)板，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度A490 nm值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，符合正態(tài)分布以±s表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，其中兩兩間比較用LSD法比較，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1不同劑量UVA對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響UVA劑量高于10 J/cm2時(shí)對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。25 J/cm2時(shí)其抑制率達(dá)37.65%，見(jiàn)表1。

表1不同劑量UVA對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響

2.2不同濃度GSPE對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響GSPE濃度為5～200 μg/mL時(shí)，對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖作用不明顯，濃度為500 μg/mL時(shí)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00），見(jiàn)表2。

2.3不同濃度GSPE（μg/mL）對(duì)25 J/cm2UVA照射HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響GSPE為50、100μg/mL時(shí)對(duì)UVA照射后的HaCaT細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00），見(jiàn)表3。

表2 不同濃度GSPE對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響

表3　不同濃度GSPE（μg/mL）對(duì)25 J/cm2UVA照射HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響

3　討論

日光中的紫外線（Utltraviolet，UV）分為3個(gè)波段，導(dǎo)致皮膚損傷的主要是UVA和UVB。過(guò)多的接觸紫外線可造成皮膚的氧化損傷，進(jìn)而引起光老化、皮膚癌變、免疫抑制等相關(guān)疾病的發(fā)生。紫外線作用的靶點(diǎn)主要是角質(zhì)細(xì)胞、黑素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，這三種細(xì)胞也對(duì)其具有阻擋、吸收的作用。角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮的主要構(gòu)成細(xì)胞，占表皮細(xì)胞的90%，而照射到皮膚的紫外線95%被其吸收。人角質(zhì)形成細(xì)胞株（HaCaT細(xì)胞）保留了表皮細(xì)胞的大部分分化能力，因此與正常人角質(zhì)形成細(xì)胞在生物學(xué)特性上極為相似。以往的研究多集中在UVB對(duì)其增殖代謝的影響方面，UVA對(duì)其增殖活性的影響少有報(bào)道，且結(jié)果大相徑庭。有報(bào)道5～10 J/cm2UVA照射HaCaT細(xì)胞即可出現(xiàn)光損傷［1-3］；也有報(bào)道生理劑量－普通日照約2 h（25 J/cm2UVA）照射，對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞膜無(wú)明顯的損傷作用［4］，還有用30J/ cm2UVA照射HaCaT細(xì)胞作為光損傷模型的［5］。本實(shí)驗(yàn)研究中，當(dāng)UVA的劑量低于10 J/cm2時(shí)，可輕度促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖，具體機(jī)制不明，推測(cè)可能為輕度代償性增殖或者溫度等其他因素所致。足以抑制HaCaT細(xì)胞增殖、造成明顯光損傷的UVA劑量為25 J/cm2，據(jù)此也可說(shuō)明長(zhǎng)期慢性生理劑量的紫外線照射可以抑制HaCaT細(xì)胞正常增殖，使皮膚對(duì)紫外線的防御減弱而導(dǎo)致皮膚光損傷的發(fā)生。

葡萄籽提取物原花青素是迄今為止人類所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)最有效的自由基清除劑之一，尤其是其體內(nèi)活性，是其他抗氧化劑不可比擬的，國(guó)內(nèi)有實(shí)驗(yàn)證明外用GSPE對(duì)急性光損傷所致的角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡具有防護(hù)作用［6］，但對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究顯示當(dāng)GSPE濃度小于200 μg/mL時(shí)，對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖作用不明顯，濃度為500 μg/mL時(shí)可抑制其生長(zhǎng)，證明了GSPE安全范圍大。同時(shí)當(dāng)GSPE為50～100 μg/mL時(shí)可以促使UVA照射后逐漸減少的HaCaT細(xì)胞再生，且可使其逐漸趨于正常。由此可見(jiàn)，GPSE是一種可靠的具有光保護(hù)作用的植物成分。

本研究發(fā)現(xiàn)25 J/cm2的UVA對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，而濃度為50～100 μg/mL的 GSPE有一定的光保護(hù)作用。這也為日后以HaCaT細(xì)胞為模型進(jìn)行皮膚光損傷的研究提供了理論依據(jù)。

［1］ 陳明亮，李吉，肖偉榮，等.白藜蘆醇對(duì)UVA致HaCaT細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，31（5）：635-639.

［2］李立，白雪濤，張宏偉，等.長(zhǎng)波紫外線照射對(duì)HaCaT細(xì)胞氧化損傷作用的研究［J］.環(huán)境與健康雜志，2010，27（3）：230-232.

［3］李敏，駱丹，林向飛.表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯抑制長(zhǎng)波紫外線誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷和凋亡［J］.臨床皮膚科雜志，2008，37（2）：80-83.

［4］Applegate LA，Noel A，Vile G，et al.Two genes contribute to different extents to the heme oxygenase enzyme activity measured in cultured human skin fibroblasts and keratinocytes：Implications for protection against oxidant stress［J］.Photochem Photobiol，1995，61：285-291.

［5］李建民，徐艷明，陳巧云，等.杜仲對(duì)UVA致HaCaT細(xì)胞光老化保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2010，19（9）：1316-1318.

［6］袁小英，劉瑋，謝艷飛，等.葡萄籽提取物原花青素對(duì)皮膚急性光損傷Fas蛋白及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響［J］.中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2008，17（3）：387-389.

Effects of GSPE and UVA on the Proliferation of HaCaT Cells

Shi Xianhua1，Zhang Junling2，Kang Yuan3
1.Jining No.1 People's Hospital，Jining 272000，China；2.Tianjin Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital 300120，China；3.First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China

ObjectiveIn order to observe the effects of GSPE and UVA on the proliferation of HaCaT cells，and to investigate the light protection of GSPE.MethodsThe cells proliferation were detected by MTT method.ResultsThe impact on HaCaT cells proliferation was not obvious when the concentration of GSPE was lower than 200 μg/mL.But when the concentration of GSPE was more than 500 μg/mL could significantly inhibit the growth of the cells.It could inhibit the growth of HaCaT cells when the dose of UVA was more than 10 J/cm2.And the 25 J/cm2dose of UVA could inhibit the proliferation of HaCaT cells to 37.65%.The concentration of 50 μg/mL and 100 μg/mL of GSPE could promote the proliferation of HaCaT cells which were irradiated by 25 J/cm2dose of UVA.ConclusionThe 25 J/cm2dose of UVA could inhibit the proliferation of HaCaT cells significantly.And appropriate concentration of GSPE can play a role in light protection.

Grape seed proanthocyanidin extract；Ultraviolet A；HaCaT cells長(zhǎng)波紫外線（UVA）是皮膚老化的重要因素，為進(jìn)行皮膚光老化的相關(guān)研究，需選取合適的光照劑量，并選取安全范圍大的藥物及合適的濃度進(jìn)行光保護(hù)的研究。葡萄籽提取物原花青素（Grape seed proanthocyanidin extract，GSPE）具有極強(qiáng)的抗氧化及清除自由基活性，其是否能通過(guò)影響細(xì)胞增殖起到光保護(hù)作用，暫未見(jiàn)報(bào)道，基于此進(jìn)行如下研究，為探討其延緩光老化等相關(guān)作用提供理論依據(jù)。

R758.7

A

1672-0709（2016）03-0136-03

中華醫(yī)學(xué)會(huì)皮膚性病學(xué)分會(huì)-微諾娜皮膚病學(xué)研究基金

張峻嶺，E-mail:zhangjunlingtj@126.com

2015-10-15）