李素婷　王　琳　許　倩　杜　超

(承德醫(yī)學(xué)院，河北　承德　067000)

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山楂葉總黃酮對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

李素婷王琳1許倩杜超

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000)

目的研究山楂葉總黃酮(FMCL)對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響。方法60只昆明種小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、FMCL大、小劑量組。采用56%(V/V)北京二鍋頭白酒灌胃制備急性肝損傷模型，同時(shí)按劑量每天給予FMCL(80、40 mg/kg)干預(yù)，連續(xù)灌胃14 d后處死小鼠缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況，Western印跡法定量檢測(cè)肝細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況。結(jié)果與模型組比較，F(xiàn)MCL明顯降低酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)，TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯下降(P<0.01)；與正常組比較，模型組小鼠肝組織Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，Bax蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，給予FMCL保護(hù)后，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl-2/Bax比值高于模型組(P<0.01)。結(jié)論FMCL通過(guò)上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)、下調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)，抑制酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，對(duì)急性酒精性肝損傷起到保護(hù)作用。

山楂葉總黃酮；酒精性肝損傷；肝細(xì)胞凋亡；Bcl-2；Bax

肝細(xì)胞異常凋亡在酒精性肝損傷的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用〔1〕。抑制肝細(xì)胞凋亡有利于酒精性肝損傷的防治，也是保證肝臟正常功能的關(guān)鍵因素。研究表明，Bcl-2家族相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一，Bcl-2和Bax分別作為Bcl-2家族中抗凋亡和促凋亡的代表基因，在肝細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控中起著中心作用〔2〕。山楂葉總黃酮(FMCL)是從薔薇科植物山楂的干燥葉中提取的黃酮類(lèi)化合物，具有抗心肌缺血、抗動(dòng)脈硬化、抗氧化等多種藥理作用〔3〕。對(duì)大鼠腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡具有明顯保護(hù)作用〔4〕。本研究觀察 FMCL對(duì)酒精引起肝細(xì)胞凋亡的抑制作用及對(duì)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物、藥品及儀器昆明種小鼠，雄性，清潔級(jí)，體重(22±2)g，石家莊實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心提供。FMCL(純度80%)：北京中醫(yī)藥大學(xué)饋贈(zèng)，臨用前以蒸餾水配置，4℃保存；56°紅星二鍋頭白酒：北京紅星釀酒廠生產(chǎn)；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒，β-actin、Bcl-2、Bax 兔抗鼠多克隆抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，均由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供；BCA蛋白定量試劑盒：上海生物工程有限公司提供；ECL超敏發(fā)光液：北京普利萊公司提供；Olympus顯微鏡和組織切片機(jī)：德國(guó)Leica公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物造模與藥物處理〔5〕將60只昆明種小鼠隨機(jī)分為4組，分別為正常組、模型組、FMCL小劑量(40 mg/kg)組、FMCL大劑量(80 mg/kg)組。正常組每天給予蒸餾水0.4 ml灌胃，模型組和FMCL給藥組按8 ml·kg-1·次-1灌胃給予56°二鍋頭白酒，2次/d，連續(xù)14 d造模結(jié)束。自造模第1天起，F(xiàn)MCL組在每天下午1點(diǎn)灌胃給藥1次，正常組和模型組同時(shí)灌服等體積蒸餾水，實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠自由飲水、進(jìn)食。最后一次灌胃結(jié)束，禁食不禁水14 h，斷頭處死小鼠。

1.2.2TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況采用TUNEL對(duì)肝臟凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。凋亡的肝細(xì)胞多表現(xiàn)為胞膜完整、核改變，細(xì)胞核呈棕黃色染色或細(xì)胞質(zhì)因核DNA逸出而呈陽(yáng)性染色者為凋亡細(xì)胞，肝細(xì)胞凋亡小體也呈陽(yáng)性著色。每例選5個(gè)高倍視野(400倍)觀察凋亡細(xì)胞，計(jì)數(shù)不少于500個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽(yáng)性肝凋亡細(xì)胞核數(shù)占該視野肝細(xì)胞核總數(shù)的比例，取均值以百分?jǐn)?shù)表示，以凋亡指數(shù)(AI)反映肝細(xì)胞凋亡情況。

1.2.3Western印跡檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)肝臟組織蛋白提取，取肝臟組織約100 mg加入冰預(yù)冷適量細(xì)胞裂解液，制成肝細(xì)胞勻漿。冰上裂解40 min，4℃，12 000 r/min離心2 min，收集上清液，按照BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白定量測(cè)定。Western印跡技術(shù)檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)，每份樣品取50 μg蛋白質(zhì)，與5×SDS加樣緩沖液混合，100℃變性5 min，8%SDS-聚丙烯凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；該膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，室溫下與一抗(1∶200稀釋)共同孵育，再與羊抗兔IgG/HRP二抗(1∶3 000稀釋)室溫孵育1.5 h，按照ECL免疫檢測(cè)試劑盒進(jìn)行曝光、顯影、洗片。以β-actin(1∶200稀釋)雜交作為內(nèi)參照，膠片經(jīng)掃描儀掃描后獲得圖像。用Quantity One分析軟件測(cè)定條帶灰度值(Bcl-2、Bax蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照β-actin蛋白條帶灰度值)，計(jì)算Bcl-2、Bax蛋白的的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件行方差分析及q檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1FMCL對(duì)酒精引起小鼠肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用TUNEL結(jié)果顯示，正常組小鼠肝組織無(wú)或偶見(jiàn)肝細(xì)胞凋亡〔(2.92±0.88)%〕；模型組小鼠肝組織中可見(jiàn)大量棕黃色、棕褐色凋亡細(xì)胞核，散在分布于肝小葉內(nèi)，肝細(xì)胞AI〔(11.41±1.13)%〕比正常組明顯升高(P<0.01)；和模型組比較，F(xiàn)MCL大、小劑量組肝細(xì)胞凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，染色強(qiáng)度減弱，AI明顯降低〔(7.96±1.84)%、(9.78±2.43)%,P<0.01，P<0.05〕，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系。表明FMCL能明顯抑制酒精誘發(fā)的肝細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖1。

圖1　FMCL對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響(TUNEL，×400)

2.2FMCL對(duì)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響表1、圖2所示，與正常組比較，模型組肝組織中Bcl-2表達(dá)明顯降低，Bax表達(dá)明顯升高，Bcl-2/Bax比值明顯低于正常組(P<0.01)，表明酒精通過(guò)下調(diào)抑凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)，使線(xiàn)粒體膜通透性改變，引起肝細(xì)胞異常凋亡；給予FMCL保護(hù)后，肝組織Bcl-2表達(dá)明顯升高，Bax表達(dá)明顯降低，Bcl-2/Bax比值明顯高于模型組(P<0.01，P<0.05)。表明FMCL通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)，保護(hù)線(xiàn)粒體的結(jié)構(gòu)與功能，抑制肝細(xì)胞異常凋亡進(jìn)而起到保肝作用。

表1　FMCL對(duì)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

1.正常組；2.模型組；3.FMCL小劑量組；4.FMCL大劑量組圖2　FMCL對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

3　討　論

凋亡與增殖的動(dòng)態(tài)平衡是維持組織自穩(wěn)態(tài)所必需的最基本過(guò)程。但過(guò)度凋亡則會(huì)引起組織損傷，進(jìn)而導(dǎo)致功能障礙。近年研究表明，肝細(xì)胞異常凋亡與許多肝臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)，病毒感染、毒性物質(zhì)、酒精等均可誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡，引起各種急慢性肝損傷〔6〕。酒精作為肝細(xì)胞的一種凋亡誘導(dǎo)劑，介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡在酒精性肝病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用〔7〕。

肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生是受多種相關(guān)基因調(diào)控的。在眾多凋亡調(diào)控基因中，Bcl-2基因家族是最有效的調(diào)控物質(zhì)，它們通過(guò)激活一系列下游基因發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用，在凋亡基因調(diào)控中起著中心作用〔8〕。Bcl-2家族是一個(gè)多基因家族，目前被認(rèn)為和凋亡關(guān)系最密切的是Bcl-2和Bax。Bcl-2是公認(rèn)的凋亡抑制基因，它編碼的蛋白位于線(xiàn)粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜上，其抗凋亡作用機(jī)制是抗氧化、調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體的通透性、防止細(xì)胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子的釋放，使凋亡效應(yīng)蛋白酶鏈Caspase-3不能激活而發(fā)揮抗凋亡作用〔9〕。而B(niǎo)ax是目前Bcl-2家族中研究最廣泛的促凋亡基因，正常細(xì)胞中Bax定位于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)受到損傷或刺激后，激活的Bax結(jié)合在線(xiàn)粒體膜上，建立線(xiàn)粒體膜通道，介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔10〕。當(dāng)Bcl-2過(guò)量表達(dá)時(shí)，可形成Bcl-2同源二聚體，能有效抑制各種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。而B(niǎo)ax過(guò)度表達(dá)時(shí)，則形成Bax同源二聚體直接啟動(dòng)或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，或與Bcl-2結(jié)合成異源二聚體，抑制Bcl-2的抗凋亡作用的發(fā)揮〔11〕。因此，Bcl-2與Bax表達(dá)水平的平衡結(jié)果決定了凋亡信號(hào)刺激后細(xì)胞的存活或凋亡，Bcl-2/Bax比值是肝細(xì)胞凋亡的決定性因素之一。一切干預(yù)細(xì)胞凋亡的因素都可最終歸結(jié)為對(duì)Bcl-2/Bax比值的改變，發(fā)揮促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡的作用〔12〕。

本研究表明酒精介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致肝損傷的主要原因，F(xiàn)MCL通過(guò)抑制肝細(xì)胞凋亡進(jìn)而起到保肝作用。酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞毒性損傷造成Bax高水平表達(dá)，過(guò)度表達(dá)的Bax形成Bax同源二聚體或與Bcl-2結(jié)合成異源二聚體，致使Bcl-2/Bax明顯下降，造成線(xiàn)粒體膜通透性增加，膜通道開(kāi)放，細(xì)胞色素C大量釋放，加速肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝細(xì)胞損傷。FMCL通過(guò)上調(diào)肝組織抑凋亡基因Bcl-2的表達(dá)、下調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)，提高Bcl-2/Bax比值，發(fā)揮抗凋亡進(jìn)而保肝的功效，這可能是FMCL對(duì)酒精性肝損傷具有保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。

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〔2015-01-16修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.011

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.12276104D-93)

李素婷(1963-)，女，碩士，教授，主要從事中藥對(duì)肝損傷保護(hù)作用及其分子機(jī)制研究。

R575

A

1005-9202(2016)14-3375-03；

1新樂(lè)市醫(yī)院