王育選，任建宏，王鵬麗，趙娟

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

?

植物激素對大花蕙蘭叢生芽增殖與生長的影響

王育選，任建宏，王鵬麗，趙娟*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

摘要：[目的] 研究不同種類、濃度及配比的植物激素對大花蕙蘭叢生芽增殖與生長的影響。[方法]以大花蕙蘭試管苗為外植體，接種于附加不同種類、濃度及配比植物激素的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。[結(jié)果]不同濃度6-BA、KT、ZT與同一濃度NAA(0.2 mg·L-1)配比時(shí)，均可誘導(dǎo)大花蕙蘭不定芽分化叢生芽，實(shí)現(xiàn)增殖，但增殖倍率和苗的生長情況存在差異，其中以培養(yǎng)基為MS+6-BA 3 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1時(shí)，大花蕙蘭叢生芽增殖倍率最高，達(dá)3.57倍，且叢生芽生長健壯，葉片濃綠；在附加ZT的培養(yǎng)基中，叢生芽增殖倍率低，最高為2.07倍，且叢生芽生長較慢，不夠健壯，但試管苗不易褐化。同一濃度BA(3 mg·L-1)與不同濃度IBA配比時(shí)，以IBA 1.0 mg·L-1時(shí)叢生芽增殖倍率略低，為2.03倍，但苗生長健壯，可直接成苗。[結(jié)論]不同植物激素對大花蕙蘭叢生芽增殖和生長的影響不同，其最適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 3 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。

關(guān)鍵詞：大花蕙蘭；叢生芽；植物激素；增殖倍率

大花蕙蘭(Cymbidiumhybridium)又名西姆比蘭、虎頭蘭、蟬蘭，為蘭科蘭屬植物，是世界五大重要商品蘭花之一，具有很高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，市場需求量大[1]。由于蘭花結(jié)實(shí)率低，分株能力弱，以傳統(tǒng)的有性、無性繁殖方法擴(kuò)繁植株速度較慢,不能滿足大規(guī)模商品化生產(chǎn)的需求,利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖蘭花可以極大提高其繁殖率，加速繁育速度,縮短育種周期,實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)[2，3]。

目前，大花蕙蘭組織培養(yǎng)的相關(guān)報(bào)道中，多數(shù)研究是由外植體分化原球莖后，通過原球莖增殖實(shí)現(xiàn)其快速繁殖[4～6]，此途徑的發(fā)生過程需要外植體經(jīng)歷脫分化和再分化，增加了原球莖再生植株的變異率。由叢生芽增殖途徑快繁材料，具有繁殖速度快、再生植株遺傳性狀穩(wěn)定的特點(diǎn)，此途徑已在蝴蝶蘭的快速繁殖[7，8]上獲得成功。因此，利用叢生芽增殖途徑實(shí)現(xiàn)大花蕙蘭快速繁殖，在短期內(nèi)提供大量遺傳性狀一致的再生植株，對推廣大花蕙蘭新品種、滿足其商品化生產(chǎn)的需求具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究通過添加不同濃度和種類的多種植物激素，研究其對大花蕙蘭叢生芽增殖與生長的調(diào)控作用，以期獲得促進(jìn)大花蕙蘭叢生芽增殖和生長的最適宜激素濃度，為其大量快速繁殖提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

大花蕙蘭(Cymbidiumhybridium)試管苗由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)獲得。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體的選取

以大花蕙蘭生長健壯試管苗為外植體，切取不定芽(從基部與老假鱗莖相連處切斷)，接種于不同培養(yǎng)基中。

1.2.2不同濃度和種類植物激素配比設(shè)置

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度6-BA、KT、ZT分別與NAA 0.2 mg·L-1(前期試驗(yàn)篩選的適宜濃度)配比，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種

3個(gè)材料，40 d后，統(tǒng)計(jì)叢生芽的增殖和生長情況。

1.2.3培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境

本試驗(yàn)所用培養(yǎng)基均以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖30 g·L-1，瓊脂6 g·L-1， pH值調(diào)節(jié)至5.6～5.8，121 ℃高壓滅菌20 min。培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，光照16 h·d-1，光照強(qiáng)度2 000～3 000 Lx。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

增殖倍率=分化出的叢生芽總數(shù)/接種數(shù)，試驗(yàn)采集的數(shù)據(jù)均由DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.16-BA與NAA配比對大花蕙蘭增殖的影響

由表1可見，在附加NAA 0.2 mg·L-1的MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的6-BA，接種材料培養(yǎng)40 d后，不定芽在所設(shè)培養(yǎng)中均可分化出叢生芽，實(shí)現(xiàn)增殖，但叢生芽的增殖倍率和生長情況有差異。隨著6-BA濃度的增加，叢生芽增殖倍率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，其濃度為3 mg·L-1時(shí)，增殖倍率最高，達(dá)3.57倍，且苗生長較健壯，葉片嫩綠；當(dāng)6-BA濃度的提高至4 mg·L-1，不僅叢生芽增殖倍率下降，而且苗生長細(xì)弱，出現(xiàn)部分畸形苗。此外，在所設(shè)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的叢生芽均出現(xiàn)較明顯地褐化現(xiàn)象。綜合考慮，在 MS培養(yǎng)基中附加6-BA 3 mg·L-1與NAA 0.2 mg·L-1配比時(shí)，可作為誘導(dǎo)大花蕙蘭叢生芽增殖與生長的適宜培養(yǎng)基(圖1)。

表1　不同6-BA/NAA配比對大花蕙蘭叢生芽增殖與生長的影響

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。表2～表4同。

Note：Different lowercase letters show significant difference at the 0.05 level in the same column. The same in Table 2～4.

圖1　6-BA與NAA配比對大花蕙蘭增殖的影響Fig.1　Effect of different 6-BA/NAA concentration on the proportion and growth of Cymbidium hybridium

2.2KT與NAA配比對大花蕙蘭增殖的影響

由表2可見，在MS+NAA 0.2 mg·L-1基本培養(yǎng)基上添加不同濃度的KT，培養(yǎng)40 d后，接種的不定芽也可分化叢生芽；增殖倍率的變化趨勢與附加6-BA時(shí)一致，先升高后下降。KT濃度為3 mg·L-1時(shí)，增殖倍率最高，達(dá)到2.53倍，且苗生長較健壯；當(dāng)KT濃度為4 mg·L-1時(shí)，叢生芽增殖率下降，在所設(shè)培養(yǎng)基中附加KT時(shí)的芽增殖倍率均低于附加相同濃度的6-BA。當(dāng)KT濃度小于3 mg·L-1時(shí)，叢生芽生長健壯，葉片嫩綠；隨著KT濃度的提高，增殖苗生長受抑，出現(xiàn)比較明顯的褐化現(xiàn)象，部分葉片發(fā)黃。在所設(shè)置培養(yǎng)基中，以MS+KT 3 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1為好，不定芽增值率較高，苗生長良好。

2.3ZT與NAA配比對大花蕙蘭叢生芽增殖與生長的影響

由表3可見，不同濃度ZT與NAA配比時(shí)，隨著ZT濃度的增加，不定芽增殖倍率逐漸增加，但各濃度之間差異不顯著，且苗長勢一般，較細(xì)弱。與相同濃度6-BA、KT與NAA的配比相比，不同濃度的ZT與NAA配比時(shí)，大花蕙蘭叢生芽增殖倍率較低，且分化出的叢生芽生長較慢，苗不如前兩者健壯，但在附加不同濃度ZT的培養(yǎng)基中，均未見叢生芽出現(xiàn)明顯的褐化現(xiàn)象(圖2)。

表2　不同KT/NAA配比對大花蕙蘭幼苗增殖培養(yǎng)的影響

表3　不同ZT/NAA配比對大花蕙蘭幼苗增殖培養(yǎng)的影響

2.46-BA與IBA配比對大花蕙蘭叢生芽增殖與生長的影響

由表4可見，在MS+6-BA 3 mg·L-1基本培養(yǎng)基上添加不同濃度的IBA，隨著IBA濃度的增加，不定芽增殖倍率逐漸增加，但各組合間差異不大，分化出的叢生芽長勢良好，葉片嫩綠；與使用6-BA與NAA配比時(shí)相比，增殖倍率偏低，但叢生芽生長健壯，可直接成苗(圖3)。

圖2　添加不同細(xì)胞分裂素對大花蕙蘭褐化程度的影響Fig.2　Effect of different cytokinin on the browning rate of Cymbidium hybridium

處理編號Code6-BA/mg·L-1IBA/mg·L-1接種數(shù)/個(gè)Inoculationnumber芽增殖總數(shù)/個(gè)Totalbudproliferation增殖倍率Proliferationrate叢生芽生長狀況ThegrowthconditionofmultipleshootclumpsD130.230531.77b長勢一般,葉綠D230.530571.9a長勢一般,葉綠D331.030612.03a長勢一般,葉綠

圖3　6-BA與IBA配比對大花蕙蘭增殖的影響Fig.3　Effect of different 6-BA/IBA concentration on the proportion and growth of Cymbidium hybridium

3　討論與結(jié)論

一般在蘭科植物的離體培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中激素(尤其是細(xì)胞分裂素和生長素)的種類與配比是調(diào)控叢生芽分化與生長的關(guān)鍵[9]。生長素抑制側(cè)芽萌發(fā)，維持植株的頂端優(yōu)勢，而細(xì)胞分裂素卻可消除頂端優(yōu)勢，促進(jìn)側(cè)芽生長。當(dāng)生長素比例高于細(xì)胞分裂素時(shí)，主要誘導(dǎo)植物生根或形成愈傷組織；當(dāng)細(xì)胞分裂素比例高于生長素濃度時(shí)，主要誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生和再分化[10]。現(xiàn)有關(guān)于大花蕙蘭組織培養(yǎng)的研究表明，低濃度細(xì)胞分裂素(0.8 mg·L-1)可促進(jìn)原球莖的分化，而較高濃度的細(xì)胞分離素(1 mg·L-1以上)可以誘導(dǎo)叢生芽分化[11～13]。本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，較高濃度的6-BA、KT、ZT(1～4 mg·L-1)分別與相同濃度的NAA配比，均可誘導(dǎo)大花蕙蘭不定芽分化叢生芽，實(shí)現(xiàn)增殖，但三者對叢生芽增殖與生長的影響存在差異。其中，6-BA促進(jìn)增殖效果最佳，叢生芽生長健壯，葉片濃綠；KT促增殖效果略低于BA，叢生芽長勢較好，葉片嫩綠；ZT促增殖效果最差，且不同濃度的ZT與NAA配比對大花蕙蘭叢生芽增殖與生長的影響差異不顯著，不同種類細(xì)胞分裂素對叢生芽增殖的影響為6-BA>KT>ZT。使用6-BA與KT時(shí)，都是濃度為3 mg·L-1時(shí)，增殖倍率最高。隨著濃度的提高，增殖率反而下降。這可能是因?yàn)榧?xì)胞分裂素在一定濃度范圍內(nèi)對植物生長起促進(jìn)作用，當(dāng)其濃度過高時(shí)則抑制芽的發(fā)生，使細(xì)胞體積因強(qiáng)烈的活動而急劇縮小，導(dǎo)致已形成的芽不能正常萌發(fā)生長。ZT也能促進(jìn)不定芽分化叢生芽，但作用效果不如6-BA和KT[14]。

IBA也是常用的生長素，在某些植物的離體培養(yǎng)中，IBA較NAA更有利于叢生芽的增殖與生長。但在本試驗(yàn)中，不同濃度的IBA與6-BA配比對叢生芽增殖的影響較小，但叢生芽生長健壯，葉片嫩綠。因此，可根據(jù)研究和生產(chǎn)的具體目的和要求選擇不同的激素配比來誘導(dǎo)大花蕙蘭叢生芽增殖。

另外，由于蘭花組織中的多酚氧化酶活性較強(qiáng)，易積累大量酚類物質(zhì)而導(dǎo)致植株褐化。褐化過程中，植物組織中的酚類物質(zhì)被氧化為醌類物質(zhì)并逐漸擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，毒害所培養(yǎng)的材料，導(dǎo)致其褐化死亡[15]。研究表明,蘭花啟動培養(yǎng)后，3/4植株因褐化死亡[16]。因此防止和減少褐化一直是蘭花快速繁殖過程的關(guān)鍵問題之一。本研究中，附加ZT的培養(yǎng)基中幼苗增殖倍率較低，但培養(yǎng)過程中沒有出現(xiàn)明顯褐化，而在添加6-BA、KT的培養(yǎng)基中均出現(xiàn)不同程度的褐化。因此可知，培養(yǎng)材料的褐化程度與培養(yǎng)基中添加的細(xì)胞分裂素的種類密切相關(guān)，如何能更好的通過調(diào)控激素的配比和使用來控制不定芽的生長分化及褐化程度，還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]范成明，李枝林，何月秋．蘭花組織培養(yǎng)及分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]．園藝學(xué)報(bào)，2003,30(4):487-491.

[2]鄒宗蘭，秦庭豪,文穎.大花蕙蘭工廠化繁殖技術(shù)研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007,20(4):743-746.

[3]楊錄軍，李曉青.大花蕙蘭組培工廠化生產(chǎn)技術(shù)[J].北方園藝，2007(8):186-187.

[4]張樹珍，曾憲松，張銀東.大花蕙蘭的組織培養(yǎng)[J].熱帶作物研究，1995(4):26-28．.

[5]謝利,馬曉娟,郭和蓉,等.雜交蘭類原球莖增殖中芽分化的控制和快速繁殖[J].植物生理學(xué)報(bào)，2014,50(2):209-213.

[6]周音,張建軍,殷麗青.植物生長調(diào)節(jié)劑對個(gè)大花蕙蘭品種類原球莖及不定芽誘導(dǎo)的影響[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013,29(1):15-17.

[7]劉榮維，梅慶超，崔元方.叢生芽—蝴蝶蘭無性快速繁殖新途徑[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，1993,14(2):105-107.

[8]譚文澄，戴策剛.觀賞植物組織培養(yǎng)技術(shù)[M].北京：中國林業(yè)出版社，1991:60-65.

[9]柳俊,謝從華.植物細(xì)胞工程.2版.[M].北京:高等教育出版社,2011:33-36.

[10]黃學(xué)林,李筱菊.高等植物組織離體培養(yǎng)的形態(tài)建成及其調(diào)控[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1992:65-68.

[11]韓明，李晏萍，潘學(xué)峰.利用叢生芽增殖途徑對大花蕙蘭進(jìn)行離體快繁[J].熱帶生物學(xué)報(bào)，2012,3(3):261-266．

[12]張晨晨,余家平,蔣琳.大花蕙蘭高頻再生體系的研究[J].植物學(xué)生理通訊,2007,43(6):1101-1104.

[13]樊家榮，孟想想，曹可.大花蕙蘭組培快繁技術(shù)研究[J].生物學(xué)雜志，2014,31(6)：99-102.

[14]徐宏英,趙玉明,謝海軍.大花蕙蘭組織培養(yǎng)快繁影響因素分析[J].園藝學(xué)報(bào),2002,29(2):183-185.

[15]李友勇,李秀菊.應(yīng)用生物技術(shù)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社,2004:59-60.

[16]周音,張建軍,殷麗青.復(fù)合抗氧化劑對大花蕙蘭組織培養(yǎng)的影響[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,29(2):14-16.

(編輯：馬榮博)

收稿日期：2016-05-19 修回日期：2016-06-09

作者簡介：王育選(1968-)，男(漢)，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：植物組織培養(yǎng) *通訊作者：趙娟，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。Tel：13834836658；E-mail:sxndzhaojuan@163.com

基金項(xiàng)目：山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20130311014-1) ；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士科研啟動項(xiàng)目(2012YJ13)

中圖分類號：S644.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1671-8151(2016)09-0628-05

Effect of phytohormone on the proliferation and growth of clustered shoots inCymbidiumhybridium

Wang Yuxuan, Ren Jianhong, Wang Pengli, Zhao Juan*

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Abstract:[Objective]The effects of variety and concentration of several hormones were investigated on proliferation and growt of multiple shoot clumps of Cymbidium hybridium. [Methods] The test-tube plantlet of Cymbidium were used as explants to be cultured in the MS medium with different variety and concentrations of hormones. [Results]The results showed that added different concentrations 6-BA、KT、ZT and NAA(0.2 mg·L-1) in MS medium could induce differentiation of Multiple shoot clumps, but there were some differences on proliferation rate and growth condition of multiple shoot clumps. The most optimal medium for proliferation and growth of multiple shoot clumps was MS+6-BA3 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1,with the highest proliferation ratio 3.57. The test-tube plantlet were not appear brown in medium added ZT. The optimal concentration of IBA was 1.0 mg·L-1when added the same concentration of BA (3 mg·L-1) and different concentration IBA in MS medium, with the lower proliferation rate compared with added 6-BA and NAA, but the multiple shoot clumps growed vigorously and seedlings directly generated. [Conclusion] There were different influence for different plant hormones on proliferation and growth of multiple shoot clumps and the the optimum medium for it was MS+6-BA 3 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1.

Key words:Cymbidium hybridium; Clustered shoots; Phytohormone; Proliferation ratio