胡韻儀，侯麗淳，季方茹，潘洪秀

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

佳木斯地區(qū)MTHFR基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的關(guān)系分析①

胡韻儀，侯麗淳，季方茹，潘洪秀

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探討佳木斯地區(qū)亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的關(guān)系。方法：選取缺血性腦卒中患者181例為實(shí)驗(yàn)組，健康體檢者169例為對照組。通過熒光原位雜交法檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組MTHFRC677T、A1298C位點(diǎn)基因多態(tài)性。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組和對照組MTHFRC677TCC、CT、TT基因型比例分別為17.68%/20.71%、37.02%/47.34%、45.30%/31.95%，兩組差異有顯著性(P<0.05)；MTHFRA1298CAA、AC、CC基因型比例分別為58.56%/58.58%、37.02%/38.46%、4.42%/2.96%，差異沒有顯著性(P>0.05)。結(jié)論：MTHFRC677T基因多態(tài)性與缺血性腦卒中具有相關(guān)性，T等位基因可能是缺血性腦卒中的易感基因；MTHFRA1298C基因多態(tài)性與缺血性腦卒中沒有關(guān)系。

缺血性腦卒中；MTHFR；基因多態(tài)性

腦卒中，又稱中風(fēng)或腦血管意外，是由于腦部供血受阻而迅速發(fā)展的腦功能損失?？梢蜓ɑ蛩ㄈ斐傻娜毖虺鲅稹Ｆ渲腥毖阅X卒(IschemicStroke，IS)中約占60%～70%。它是一大類嚴(yán)重威脅著人類健康和壽命的常見疾病[1]，其發(fā)病機(jī)理尚不完全明了，有待于進(jìn)一步進(jìn)行研究探討。

亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylene-tetrahydrofolatereductase,MTHFR)，是葉酸(FolicAcid)代謝過程中的關(guān)鍵酶。該酶遺傳缺陷則引起葉酸代謝中5,10-亞甲基四氫葉酸不能還原成5-甲基四氫葉酸，因而不能為同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)代謝途徑中合成蛋氨酸和DNA合成提供甲基供體，使Hcy代謝受阻，導(dǎo)致體內(nèi)Hcy水平的升高[2～4]。同型半胱氨酸可對血管內(nèi)皮產(chǎn)生毒性作用，促進(jìn)動脈斑塊的形成，干擾血管平滑肌的正常功能[5～7]。MTHFR是一種酶蛋白，在體內(nèi)的合成受MTHFR基因調(diào)控，當(dāng)基因發(fā)生變異時，MTHFR酶蛋白合成受阻，引起酶含量減少，從而引起代謝異常。人類MEHFR基因具有兩千多個變異位點(diǎn)(NCBISNP收載)，目前研究較多的是MTHFRC677T(rs1801133)以及A1298C(rs1801131)基因位點(diǎn)的突變，二者的突變可導(dǎo)致血漿高同型半胱氨酸和低葉酸狀態(tài)[2]。國內(nèi)外已有文獻(xiàn)報道C677T以及A1298C基因位點(diǎn)的突變與腦卒中相關(guān)[3，8，9]，同時也有不相關(guān)的報道[10，11]。為了探討MTHFR基因多態(tài)性是否具有相關(guān)性，我們選擇佳木斯地區(qū)腦卒中人群使用熒光原位雜交(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)法進(jìn)行MTHFR基因多態(tài)性檢測，以確定其與腦卒中的相關(guān)性，并為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015-10～2016-06來院就診的腦卒中患者181例為實(shí)驗(yàn)組，其中男136例,女45例，年齡40～72歲，平均(53.13±5.09)歲，所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會-各類腦血管病診斷要點(diǎn)要求，均行頭顱CT和(或)MRI檢查，并確診為缺血性腦卒中診斷；病例之間無血緣關(guān)系，有當(dāng)?shù)貞艏幼?0年以上；均簽署知情同意書。同時選取本院體檢健康人169例為對照組，其中男94例，女75例，年齡40～64歲，平均(52.37±4.42)歲，排除冠心病、高血壓、腦血管疾病等。實(shí)驗(yàn)組與對照組差異沒有顯著性。

儀器：TL-988實(shí)時熒光定量PCR儀(西安天隆科技儀器有限公司)，熒光原位雜交DNA測序分析程序(北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司)，HC-3017高速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)，1～1000μLFINNPIPETTE移液器(Thermoscientific公司)。

試劑：PHARM-GENE01SNP分析保存液，PHARM-GENE200MTHFRC677T、A1298CSNP分析樣品處理試劑(北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 富集白細(xì)胞

取150μL新鮮全血加入含有1000μL氯化銨溶液的1.5mL塑料試管中，顛倒混勻后室溫放置10min，3000r·min-1離心5min，用移液器吸出上清液。

1.2.2 加樣

在富集了白細(xì)胞的管中加入100μL耀金保，震蕩混勻，室溫放置20～30min。吸取本液1.0～1.5μL加入待測基因?qū)?yīng)的耀金分試劑中，漩渦混勻，瞬時離心，上機(jī)檢測。在樣品檢測的同時，加測3種不同基因型的質(zhì)控品作為對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)組與對照組檢測結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有高度顯著性。

2 結(jié)果

2.1 基因型分析

根據(jù)與試劑隨行的軟件設(shè)定液和三種基因型質(zhì)控品顯示的圖譜及St值(熒光曲線出現(xiàn)拐點(diǎn)時的循環(huán)數(shù))設(shè)定軟件參數(shù)，參數(shù)設(shè)定后，試驗(yàn)樣品自動顯示測定結(jié)果的基因型。

MTHFRC677T、A1298C擬合曲線見圖1。

圖1 MTHFR C677T三種基因型和MTHFRA1298C三種基因型擬合曲線圖

2.2 基因型檢測結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)使用熒光原位雜交法檢測MTHFRC667T、A1298C兩個位點(diǎn)，共檢測腦卒中患者(實(shí)驗(yàn)組)血樣181份，健康對照組169份，見表1。

表1 MTHFR C677T、A1298C基因型檢測結(jié)果

由檢測結(jié)果通過卡方統(tǒng)計分析可見，實(shí)驗(yàn)組與對照組MTHFRC677T不同基因型差異有顯著性，(χ2=6.865,P<0.05)，等位基因差異有高度顯著性，(χ2=12.84 ，P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組TT基因型及T等位基因頻率均高于對照組(45.30/31.95、63.81/55.62)實(shí)驗(yàn)組CC、CT基因型均低于對照組(17.68/20.71、37.02/47.34)，實(shí)驗(yàn)組C等位基因低于對照組(36.19/44.38)。表明T等位基因?yàn)槟X卒中易感堿基。實(shí)驗(yàn)組與對照組MTHFRA1298C不同基因型及不同堿基差異沒有顯著性，將含有變異堿基AC和CC合并后差異也沒有顯著性(P>0.05)。

3 討論

目前，基因多態(tài)性對疾病易感的影響是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)研究的內(nèi)容，在基因多態(tài)性對腦卒中易感的關(guān)系研究中，MTHFR基因多態(tài)性是一個主要方面，但是研究結(jié)果不盡相同，武漢大學(xué)的韓瑞玲[3]、鄭州大學(xué)的施夢麗[8]、天津第一中心醫(yī)院Bao-ShengZhou[9]等人的研究認(rèn)為MTHFRC677T的TT等位堿基是腦卒中的易感基因(P<0.01),本研究結(jié)果與其一致；但同時河南科技大學(xué)的肖湘雪等人的研究卻顯示MTHFRC677T基因多態(tài)性對腦卒中沒有影響，實(shí)驗(yàn)組與對照組差異沒有顯著性(P>0.05)。天津第一中心醫(yī)院Bao-ShengZhou[9]等人的研究認(rèn)為MTHFRA1298C的CC基因型為腦卒中的易感基因(P<0.01)，而布加勒斯特維克多兒童病理學(xué)研究所的ArseneD等研究卻認(rèn)為MTHFRA1298C實(shí)驗(yàn)組與對照組幾乎沒有差異(P>0.05)，既MTHFRA1298C基因多態(tài)性與腦中風(fēng)沒有關(guān)系，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

由于各個研究者選取的病例數(shù)及對照組例數(shù)均不超過600例，所得研究結(jié)果不足以作為臨床診斷的依據(jù)，因此有必要進(jìn)行大樣本分析研究，以為臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

[1]荊鑫鑫，劉鴻飛，朱金玲,等.初發(fā)和復(fù)發(fā)性腦梗死患者血清同型半胱氨酸水平的臨床研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2014,37(5)：33-36

[2]張爽，魯衍強(qiáng)，芮欣憶,等.不同5，10_亞甲基四氫葉酸還原酶基因型人群葉酸補(bǔ)服效果評價[J].天津醫(yī)藥，2013，41(7)：628-631

[3]韓瑞玲,李艷.武漢地區(qū)缺血性腦卒中患者M(jìn)THFR基因多態(tài)性分布分析[J].神經(jīng)損傷與功能重建，2016,11(3)：200-202

[4]和梅，徐金銘，王欣.葉酸聯(lián)用維生素B12對丙戊酸鈉治療的癲癇患者血同型半胱氨酸水平的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2016,39(2)：53-54

[5]張成發(fā)，王復(fù)新，吳麗莉,等.315例缺血性腦卒中危險因素Logistic回歸分析[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2015,38(2)：153-155

[6]楊波，楊樹忠，盧志剛,等.同型半胱氨酸與頸動脈狹窄支架置入術(shù)后再狹窄程度的相關(guān)性[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2014,37(6)：102-104

[7]高雨田，彭鵬，褚春沐,等.42例腦梗死患者血清同型半胱氨酸水平研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2015,38(1)：86-87

[8]施夢麗，弓園芳，陳淅泠.同型半胱氨酸濃度及MTHFR基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)性[J].中國神經(jīng)疾病雜志，2014,17(17)：53-54

[9]ZhouBS,BuGY,LiM,etal.TaggingSNPsintheMTHFRgeneandriskofischemicstrokeinaChinesepopulation[J].IntJMolSci，2014, 15(5):8931-8940

[10] 肖湘雪,白淑鳳.MTHFR基因多態(tài)性與腦卒中的關(guān)系研究[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2012,16(7)：1311-1313

[11]ArseneD,GinG,BlescuC,etal.C677TandA1298Cmethylenetetrahydropholatereductase(MTHFR)polymorphismsasfactorsinvolvedinischemicstroke[J].RomJMorpholEmbryol，2011,52(4):1203-1207

The analysis of polymorphism relationship of MTHFR gene and ischemic stroke in jiamusi

HUYun-yi,HOULi-chun,JIFang-ru,PANHong-xiu

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China)

Objective: To analyze polymorphism relationship of methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR)gene and ischemic stroke patients in Jiamusi. Methods: Total 181 cases of ischemic stroke patients were enrolled as experimental group, and 169 healthy cases were enrolled as control group. MTHFR C677T、A1298C genotypes were detected by the Fluorescence by situ hybridization method. Results: In the experimental group and control group, MTHFR C677T genotype proportions were CC for 17.68%/20.71 %, CT for 37.02%/47.34%, TT for 45.30%/31.95%. Compared experimental group with control group, there was a significant difference (P<0.05);andMTHFRA1298CgenotypeproportionswereAAfor58.56%/58.58%;ACfor37.02%/38.46%;andCCfor4.42%/2.96%.Thedifferencewasnotstatisticallysignificant(P>0.05). Conclusion: MTHFR C677T polymorphism and ischemic stroke are relevant. T allele may be a susceptible gene for ischemic stroke. MTHFR A1298C polymorphism is not associated with ischemic stroke.

ischemic stroke; MTHFR; gene polymorphism

胡韻儀(1990～)女，黑龍江佳木斯人,在讀碩士研究生。

候麗淳(1971～)女，黑龍江佳木斯人，碩士， 副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：1312755739@qq.com。

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1008-0104(2017)01-0089-03

2016-10-09)