程艷香 陳干濤★

羥喜樹(shù)堿抗宮頸癌的機(jī)制研究

程艷香 陳干濤★

目的 探討羥喜樹(shù)堿（HCPT）對(duì)宮頸癌HeLa 細(xì)胞作用的機(jī)制。方法 利用western blot、GFP-LC3 shRNA轉(zhuǎn)染、Hoechst染色等對(duì)經(jīng)HCPT處理后的HeLa 細(xì)胞進(jìn)行自噬和凋亡水平的觀察。結(jié)果 western blot、熒光顯微鏡的結(jié)果均提示，HCPT能夠誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞中自噬相關(guān)基因Beclin-1、p62以及LC3 的表達(dá)增加，從而激活細(xì)胞自噬發(fā)生；除細(xì)胞自噬外，HCPT也可以造成細(xì)胞的凋亡，且凋亡出現(xiàn)在自噬觸發(fā)之后。結(jié)論 HCPT能夠激活宮頸癌HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到抗腫瘤目的。

羥喜樹(shù)堿 宮頸癌 自噬 凋亡

宮頸癌（Cervical cancer）是女性生殖道最常見(jiàn)的惡性腫瘤。宮頸癌的治療一般采用手術(shù)和放療為主、化療為輔的綜合治療方案。其預(yù)后與臨床期別、病理類型等密切相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后較差［1］。自噬是真核細(xì)胞的一種非細(xì)胞凋亡性程序性死亡，又被稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡。自噬現(xiàn)象可能成為包括宮頸癌在內(nèi)的腫瘤藥物治療的新靶點(diǎn)［2，3］。羥喜樹(shù)堿（HCPT）是唯一有選擇性抑制DNA Topo I作用的植物類特異性腫瘤化學(xué)治療藥物，有望成為治療惡性腫瘤（包括宮頸癌）一種有效藥物［4］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究HCPT對(duì)HeLa細(xì)胞在自噬與凋亡方面的影響，從細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的角度探討其作用機(jī)制。

1　 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；羥基喜樹(shù)堿（HCPT）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；GFP-LC3質(zhì)粒由南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。Beclin-1，p62，LC-3B，GAPDH等抗體購(gòu)自美國(guó)santa cruz公司； Bax，Bcl-2，cleavecaspase3抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法 （1）細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞活力 采用細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（CCK8）法檢測(cè)細(xì)胞活力。以5000 個(gè)/孔的密度將HeLa接種于96孔培養(yǎng)板中，12h后，分別加入1，2，4，6，8，10μM羥喜樹(shù)堿，每濃度組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立生理鹽水作陰性對(duì)照；置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。24h后每孔加入10μl 的CCK-8溶液，放置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2h，采用ELX-800型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）測(cè)定各孔450 nm處的吸光度（a）值。細(xì)胞抑制率=1-（用藥組a值/對(duì)照組a值）。通過(guò)擬合函數(shù)曲線計(jì)算藥物處理的半數(shù)抑制濃度即IC50。（2）Western blot法檢測(cè)自噬與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 將HeLa細(xì)胞均勻接種于60mm培養(yǎng)皿中，藥物處理后用預(yù)冷的PBS洗3遍，加入含有100 mmol/L PMSF的裂解液（RIPA）裂解細(xì)胞，冰上放置30min充分裂解，4℃條件下12000 r/ min離心15min，取上清液后經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度。依次進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%SDS-PAGE凝膠電泳，使用PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2h后，4℃封閉一抗過(guò)夜，TBST清洗3次（5min/次）后加入相應(yīng)二抗，室溫下孵育60min，TBST洗3次后進(jìn)行顯影，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，采用計(jì)算機(jī)軟件ImageJ分析灰度值并記錄。（3）細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化的觀察 將HeLa細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1×106，培養(yǎng)過(guò)夜，加入相應(yīng)的藥物分別處理12h和24h，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組；細(xì)胞經(jīng)PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定15min，加入Hoechst33342（杭州碧云天生物科技有限公司）避光孵育10min，PBS清洗3遍后，在熒光顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察細(xì)胞核形態(tài)并統(tǒng)計(jì)記錄。（4）細(xì)胞自噬率檢測(cè) 將HeLa細(xì)胞接種到6孔板內(nèi)，培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%。通過(guò)lipofectamine 2000（美國(guó)Life Technologies）轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒體，6h后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。之后加入羥基喜樹(shù)堿分別作用12h和24h，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛室溫固定15min，PBS清洗3次，熒光顯微鏡下觀察對(duì)GFP-LC3的陽(yáng)性自噬點(diǎn)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)對(duì)照組和處理組單個(gè)細(xì)胞中GFP-LC3點(diǎn)熒光數(shù)，每組統(tǒng)計(jì)≥25個(gè)細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)和SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　 結(jié)果

2.1 HCPT對(duì)HeLa細(xì)胞具有毒性作用 不同濃度的HCPT作用于HeLa細(xì)胞，結(jié)果表明，HCPT對(duì)細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用。其IC50約 為3μM。本實(shí)驗(yàn) 選 取IC50即3μM濃度的HCPT探究其作用機(jī)制。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度HCPT對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

2.2 HCPT能夠誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)變化 給予HeLa細(xì)胞以3μM濃度的HCPT分別處理12h和24h，通過(guò)western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示，自噬標(biāo)記蛋白Beclin1表達(dá)量增加，而自噬底物標(biāo)記蛋白p62出現(xiàn)降解，作為自噬發(fā)生指標(biāo)的LC3-II/LC3-I比值也同樣表現(xiàn)出上升，western blot結(jié)果表明，HCPT能夠引起HeLa細(xì)胞自噬，并隨藥物的作用時(shí)間的延長(zhǎng)自噬水平也出現(xiàn)升高。見(jiàn)圖2。

圖2 HCPT（3μM）誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平增加

2.3 HCPT引起HeLa細(xì)胞中GFP-LC3點(diǎn)狀分布增加 GFP-LC3目前被認(rèn)為是自噬體特異性標(biāo)簽。是一種檢測(cè)自噬發(fā)生常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，將HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFP-LC3后，用HCPT分別處理12h和24h，在熒光顯微鏡下觀察并對(duì)帶有GFP-LC3的自噬點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組的細(xì)胞，HCPT能夠明顯增加細(xì)胞自噬體的數(shù)量，進(jìn)一步證明HCPT可以誘發(fā)HeLa細(xì)胞自噬發(fā)生。見(jiàn)圖3。

圖3 熒光顯微鏡觀察經(jīng)HCPT處理后HeLa中GFP-LC3自噬點(diǎn)的分布變化

2.4 HCPT誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化 給予HeLa細(xì)胞以3μM濃度的HCPT分別處理12h和24h，經(jīng)過(guò)固定，Hoechst33342染色，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，24h處理組細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核皺縮，染色加深等凋亡形態(tài)，而12h處理組并未出現(xiàn)明顯細(xì)胞核變化，結(jié)果表明，3μM 的HCPT在處理24h細(xì)胞后可引發(fā)細(xì)胞凋亡，而12h作用并不明顯。提示HCPT引發(fā)的細(xì)胞凋亡是在細(xì)胞出現(xiàn)自噬后所引起的。見(jiàn)圖4。

圖4 HCPT誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化影響

2.5 HCPT誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白變化 為進(jìn)一步證實(shí)HCPT所引發(fā)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，通過(guò)western blot方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化，結(jié)果顯示，在細(xì)胞處理24h組中，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax 與cleave-caspase-3均出現(xiàn)表達(dá)量增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)出現(xiàn)下降。而在12h處理組中，上述蛋白并未出現(xiàn)明顯變化。Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)HCPT引發(fā)的細(xì)胞凋亡是跟隨細(xì)胞自噬發(fā)生后出現(xiàn)的。見(jiàn)圖5。

圖5 HCPT誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白變化

3　 討論

喜樹(shù)堿是從我國(guó)特有的珙垌科植物喜樹(shù)中分離提取出的五環(huán)生物堿。是唯一具有選擇性抑制DNA Topo I作用的植物類抗腫瘤藥，目前已廣泛應(yīng)用于臨床。近來(lái)國(guó)內(nèi)外已進(jìn)行大量的研究發(fā)現(xiàn)羥喜樹(shù)堿作用穩(wěn)定且不良反應(yīng)小，可有效誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞和部分非腫瘤細(xì)胞的凋亡［5］。宮頸癌是危害女性健康的第二大常見(jiàn)腫瘤，每年約造成30多萬(wàn)人死亡，并出現(xiàn)明顯的年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅廣大女性的健康。目前主要的治療手段仍是放療和化療相結(jié)合的綜合治療［6］。

本資料通過(guò)western blot和GFP-LC3 shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞等檢測(cè)方法，首次發(fā)現(xiàn)HCPT作用于HeLa細(xì)胞后能夠引發(fā)自噬，并且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其自噬水平成增強(qiáng)趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)所選取的自噬指標(biāo)蛋白中，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC 3）是目前研究較多的自噬標(biāo)志性物質(zhì)，其定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的形成，被認(rèn)為是自噬特異性形成指標(biāo)［7，8］；而另一種蛋白Beclin-1是哺乳動(dòng)物的自噬調(diào)控基因，是自噬發(fā)生的觸發(fā)器，其表達(dá)的上調(diào)可誘導(dǎo)自噬的形成，兩種自噬指示蛋白在HCPT的作用下，均出現(xiàn)表達(dá)量增加。一些研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中，自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)被抑制，從而下調(diào)了自噬的形成，造成腫瘤的不斷生長(zhǎng)，另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)自噬相關(guān)蛋白過(guò)表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)受到明顯抑制［7，8］，因此，通過(guò)誘導(dǎo)自噬形成有可能成為未來(lái)宮頸癌治療的策略之一，而本實(shí)驗(yàn)所選取的HCPT這種藥物就是通過(guò)誘導(dǎo)自噬的形成來(lái)達(dá)到抗腫瘤的目的。

同時(shí)，除能夠增加細(xì)胞的自噬外，作者通過(guò)weatern blot以及Hoechst染色也證實(shí)HCPT還可以引起細(xì)胞凋亡，并且凋亡現(xiàn)象出現(xiàn)在自噬發(fā)生之后，表明HCPT作用于細(xì)胞后，首先引起細(xì)胞自噬水平的升高，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞凋亡信號(hào)的啟動(dòng)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗腫瘤的目的。

研究認(rèn)為，自噬與凋亡的機(jī)制之間關(guān)系密切，存在著許多重疊的部分。一些觀點(diǎn)則認(rèn)為自噬是凋亡必需的，當(dāng)自噬受到抑制時(shí)會(huì)延緩凋亡的發(fā)生，而自噬水平的升高常導(dǎo)致細(xì)胞凋亡通路的激活。本資料證實(shí)，在宮頸癌細(xì)胞中，HCPT的抗腫瘤的機(jī)制是首先通過(guò)激活細(xì)胞自噬，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到其抗腫瘤的目的，也提出自噬和凋亡之間有著密不可分的關(guān)系。同樣，其他類似的研究也發(fā)現(xiàn)，順鉑作用HeLa細(xì)胞后，自噬小體形成數(shù)增加，自噬蛋白Beclin-1和LC3表達(dá)量也增加，同時(shí)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激—自噬反應(yīng)參與了順鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用［9～11］。

宮頸癌是威脅女性健康的惡性腫瘤，目前，仍無(wú)有效的治療方式。而自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要通路，在疾病中的作用逐步得到認(rèn)同。本資料表明HCPT在抗宮頸癌發(fā)生過(guò)程中的機(jī)制問(wèn)題，是通過(guò)激活細(xì)胞自噬從而抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，為HCPT在治療宮頸癌方面提供理論基礎(chǔ)，也為開(kāi)發(fā)類似藥物提供新的思路。

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2 張碧蓉，謝麗玲.自噬在宮頸癌發(fā)生發(fā)展及治療中的作用.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，20（6）：768～769.

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11 張頌婕.自噬基因ARHI與Beclin1在宮頸癌中的表達(dá)及意義.吉林大學(xué)，2013.

Objective To explore the antitumor mechanism of Hydroxycamptothecin（HCPT） on cervical cancer. Methods Western blotting and Hoechest staining Methods were used to detect the level of apoptosis and autophagy after HCPT being used on Hela which is cervical cancer cell line. Results After using HCPT，the expression of the regulators of Beclin-1，p62 and microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3） were upregulated and then the autophagy of Hela cells were triggered. In the meanwhile，the autophagy induced cell apoptosis . Conclusion HCPT can induce Hela cells apoptosis by stength the cells autophagy.

HCPT cervical cancer autophagy apoptosis

湖北省衛(wèi)生廳（ 2012Z-Y02）；湖北省衛(wèi)計(jì)委一般面上項(xiàng)目（WJ2015MB084）

430060 武漢大學(xué)人民醫(yī)院（程艷香）433000 湖北省仙桃市第三人民醫(yī)院（陳干濤）
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