楊 欣 丁彩飛 顏志中 杜 靜 胡惠敏 周紅娟

生精合劑對(duì)不育男性精子參數(shù)及精子凋亡的影響

楊 欣 丁彩飛 顏志中 杜 靜 胡惠敏 周紅娟

不育癥；精子；DNA；五子衍宗軟膠囊；生精合劑

研究[1-2]表明，以精子DNA損傷為特征的精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常是男性不育、復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）以及輔助生殖技術(shù)治療失敗的重要原因之一，精子DNA損傷亦是近年來生殖醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。迄今為止，多數(shù)男性不育癥仍缺乏令人滿意的治療方法。筆者臨床應(yīng)用生精合劑治療男性不育癥療效滿意，本研究借助流式細(xì)胞技術(shù)觀察生精合劑對(duì)不育男性精子凋亡的影響，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料2014年9月—2015年10月就診于本院生殖醫(yī)學(xué)科、男科的男性不育癥患者60例，采用簡(jiǎn)單隨機(jī)方法平行分為治療組30例，年齡23～43歲，平均（26.2±2.7）歲；病程1.5～4年，平均（2.4±1.7）年；對(duì)照組30例，年齡24～40歲，平均（25.7±3.1）歲；病程1～5年，平均（2.6±1.4）年；兩組患者的年齡、病程等基線資料分布均衡（P＞0.05），具有可比性。

1.2 西醫(yī)診斷根據(jù)《世界衛(wèi)生組織男性不育標(biāo)準(zhǔn)化檢查與診療手冊(cè)》[3]和《男科學(xué)》[4]弱精子癥男子不育診斷標(biāo)準(zhǔn)，已婚男女同居1年以上，性生活正常，未避孕而不育，精子總活力（快速前向運(yùn)動(dòng)+非快速前向運(yùn)動(dòng)）＜40%（38～42%），快速前向運(yùn)動(dòng)＜32%（31～34%）。

1.3 中醫(yī)辨證參照《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》（國(guó)家中醫(yī)藥管理局，1994年）和《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[5]擬定。腎精虧虛證：主癥：不育，精子總活力和（或）前向運(yùn)動(dòng)精子率低、精子存活率低。次癥：腰脊酸痛，脛酸膝軟或足跟痛，尿后余瀝或夜尿增多，頭暈?zāi)垦；蚨Q耳聾，面色晦暗，畏寒肢冷，小便清長(zhǎng)，性功能減退，神疲健忘，舌質(zhì)淡苔薄，脈沉細(xì)或細(xì)弱。具備主癥“不育，精子濃度低，精子總活力和（或）前向運(yùn)動(dòng)精子低，存活率低”，兼具次癥中的任2項(xiàng)及舌脈象，即可診斷。

1.4 入選標(biāo)準(zhǔn)①符合西醫(yī)診斷；②符合中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)；③年齡22～45歲；④參照WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5版，2011年），禁欲3～5天，精液常規(guī)分析2次（2次精液檢查間隔時(shí)間至少2周）顯示，精子總活力（PR+NP）＜40%（38～42%），前向運(yùn)動(dòng)精子（progressively motile，PR）＜32%（31～34%），精子存活率（sperm survival rate）＜58%（55～63%）。所有入選病例均自愿簽署知情同意書（知情同意書由我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)討論通過）。

1.5 排除/退出標(biāo)準(zhǔn)排除標(biāo)準(zhǔn)：①無精子癥；②勃起功能障礙或逆行射精或不射精等；③Ⅱ°以上精索靜脈曲張；④性腺發(fā)育不良，睪丸萎縮或缺如；⑤先天畸形、精道梗阻；⑥藥物未控制的細(xì)菌性前列腺炎；⑦近3～6個(gè)月內(nèi)高熱（T＞38℃）史；⑧正在服用抗癲、抗腫瘤等影響生精功能及精子活力的藥物者；⑨合并心血管、肝、腎和造血系統(tǒng)嚴(yán)重原發(fā)性疾病，精神病患者；⑩過敏體質(zhì)或?qū)υ囼?yàn)藥物過敏者。退出標(biāo)準(zhǔn)：治療過程中發(fā)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，或改用其他方法治療，患者因各種原因必須停藥，對(duì)研究用藥過敏者。

1.6 治療方法開始治療前，兩組患者先進(jìn)行1周的洗脫期觀察，然后治療組給予生精合劑（菟絲子、枸杞子、五味子、潼蒺藜、熟地、生曬參、淫羊藿、巴戟天、鹿角片、淮山藥、生黃芪、麥冬、全當(dāng)歸、紅花等組成，由本院制劑室制備提供，每毫升含生藥2g），1次150mL，1天2次，口服。對(duì)照組給予五子衍宗軟膠囊，1次3粒，1天3次；兩組均連續(xù)治療3個(gè)月（1個(gè)生精周期）。所有患者治療期間一律不用其他藥物、治療方法。囑患者服藥期間戒煙、酒，忌食碳酸類飲料、茶、咖啡，禁止桑拿及盆（池）浴，避免高溫環(huán)境作業(yè)。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 標(biāo)本收集于治療前和治療3個(gè)月后，禁欲3～5天，自慰法收集全部精液于干燥潔凈的玻璃容器中，置37℃恒水浴箱中30～60min待液化后備用。

1.7.2 精液參數(shù)檢測(cè)根據(jù)參照WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5版，2011年）進(jìn)行精液常規(guī)分析。采用WLJY-9000熒光染色精子動(dòng)（靜）態(tài)圖像分析系統(tǒng)（北京偉力科技發(fā)展有限公司）檢測(cè)精精子濃度（106/mL）、前向運(yùn)動(dòng)精子（PR，%）等參數(shù)。

1.7.3 精子凋亡檢測(cè)參照文獻(xiàn)[6]方法，采用精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析（SCSA）法檢測(cè)精子DNA完整性。應(yīng)用儀器及試劑：全自動(dòng)流式細(xì)胞儀（型號(hào)：Epics.XL4. MCL，出廠編號(hào)：AF36197，美國(guó)Beckman Coulter公司），熒光染料標(biāo)記的磷脂結(jié)合蛋白（Alexa Fluor 488 annexin V）和膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液（Annexinblinding buffer）（大連科生物技術(shù)有限公司提供）；Nikon E-1000熒光顯微鏡（日本Nikon公司），Olympus CX31普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.7.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料用（x±s）表示，應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 治療前后兩組患者精子濃度比較治療前兩組患者精子濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后兩組患者精子濃度均有改善（P＜0.05）；治療后兩組患者精子濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 治療前后兩組患者精子活力（a+b級(jí)，%）比較治療前兩組患者精子活力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后兩組患者精子活力（a+b級(jí)，%）均明顯有改善（P均＜0.05）；治療后治療組患者精子活力（a+b級(jí)，%）改善顯著優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05）。見表2。

表1 兩組患者治療前后精子濃度比較（106/mL，（x±s）

表2 治療前后兩組患者精子活力比較（%，x±s）

2.3 治療前后兩組患者精子凋亡率比較治療前兩組患者活精子、凋亡精子及壞死精子百分率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），治療后兩組患者活精子、凋亡精子及壞死精子百分均有不同程度改善，但治療組改善更顯著（P＜0.05）。見表3。

表3 治療前后兩組患者精子調(diào)亡率比較（%，x±s）

3 討論

男性不育癥病因復(fù)雜，目前尚缺乏有效的治療手段。中醫(yī)認(rèn)為，腎為先天之本，藏精主生殖，性與生殖機(jī)能的成熟衰退與腎的功能密切相關(guān)。腎虛則生殖機(jī)能減退，腎虛是男性不育的根本原因[7]?！澳I精不足”是少、弱精男性不育癥的基本病機(jī)。因此，“補(bǔ)腎填精”是治療少弱精男性不育癥的根本治則。

但腎虛為病，無論腎陰虛還是腎陽虛都會(huì)發(fā)生因虛致瘀的病理改變，脈絡(luò)瘀阻，血行不暢，則有礙于腎陰、腎陽的化生，惟瘀去而新生[7]。筆者前期研究表明，生精合劑單用或與抗氧化劑（維生素E、輔酶Q10）聯(lián)合應(yīng)用能顯著改善不育癥男性精子活動(dòng)率、前向運(yùn)動(dòng)率和活力指數(shù)等運(yùn)動(dòng)參數(shù)[7-8]。生精合劑以五子衍宗丸為基礎(chǔ)，在補(bǔ)腎溫陽填精的同時(shí)注重益氣養(yǎng)血活血，酌情配伍丹參、紅花等活血化瘀藥物，對(duì)于久病有血瘀證，見面色紫暗，少腹、會(huì)陰刺痛，舌暗紅或有瘀斑，脈弦澀者，尤為適宜。方中當(dāng)歸富含阿魏酸等抗氧化活性成分，菟絲子、巴戟天、淫羊藿等對(duì)超氧陰離子（O2-）、羥基自由基（·OH）等自由基有清除作用[8-9]。本研究結(jié)果顯示，生精合劑能提高不育男性精子濃度和活力（P＜0.05），顯著降低不育男性精子凋亡率（P＜0.05）。

［1］葛少欽，趙崢輝，殷會(huì)瑩，等.精子DNA損傷因素研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究與教育，2014，31（3）：61-64.

［2］王麗.SPA和精子DNA完整性檢測(cè)在IVF-ET中的應(yīng)用［D］.蘭州大學(xué)，2009.

［3］世界衛(wèi)生組織.世界衛(wèi)生組織男性不育標(biāo)準(zhǔn)化檢查與診療手冊(cè)［S］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：35.

［4］郭應(yīng)祿，胡禮泉.男科學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：115.

［5］國(guó)家中醫(yī)藥管理局.中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2002.

［6］楊建華，華詠，馬亮，等.精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的臨床意義［J］.中國(guó)男科學(xué)雜志，2006，20（12）：6-8.

［7］楊欣，丁彩飛，顏志中，等.生精合劑對(duì)不育男性精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)及精子膜完整性的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（2）：392-395.

［8］楊欣，張永華，丁彩飛，等.巴戟天水提物對(duì)人精子膜功能氧化損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)中藥雜志，2006，31（19）：1614-1617.

［9］楊欣，張永華，丁彩飛，等.應(yīng)用體外培養(yǎng)法研究淫羊藿水提物對(duì)人精子膜功能損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007，12（6）：663-666.

（收稿：2016-05-20修回：2015-05-25）

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2014ZB086）

浙江省杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（杭州310003）

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