不同貯藏溫度下大別山五針?biāo)苫ǚ刍盍Φ淖兓?/h1>
2016-08-06 06:48項小燕吳甘霖段仁燕王志高張中信王廣艷
植物資源與環(huán)境學(xué)報 2016年2期
項小燕, 吳甘霖, 段仁燕, 王志高, 張中信, 王廣艷
(安慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 安徽 安慶246133)
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不同貯藏溫度下大別山五針?biāo)苫ǚ刍盍Φ淖兓?/p>
項小燕, 吳甘霖①, 段仁燕, 王志高, 張中信, 王廣艷
(安慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 安徽 安慶246133)
關(guān)鍵詞：大別山五針?biāo)? 貯藏溫度; 貯藏時間; 花粉活力; MTT染色法
大別山五針?biāo)?PinusdabeshanensisC. Y. Cheng et Y. W. Law)為松科(Pinaceae)松屬(PinusLinn.)植物，自然種群數(shù)量極少，目前僅發(fā)現(xiàn)在安徽省岳西縣大王溝海拔900～1 300 m陰坡和半陰坡有相對集中的分布，種群規(guī)模計200余株，且多為成年個體，林下幼苗極少，自然更新困難，為中國特有珍稀樹種之一[1]。大別山五針?biāo)沙Ｔ诿磕?月份至4月份形成花芽，5月中下旬花粉成熟并散發(fā)，花粉具氣囊，此時雌球花張開接受傳粉，球果翌年9月成熟[2]。據(jù)作者近年的調(diào)查，大別山五針?biāo)煞N子敗育率較高，且種子質(zhì)量較低，這也是該種類瀕危的重要原因之一。
花粉為雄配子體，其活力和壽命對授粉、受精、種子產(chǎn)量和質(zhì)量具有直接影響[3]；花粉活力主要受植物自身遺傳特性和外界因素的影響，尤其受溫度的影響[4]；而花粉的貯藏、活力以及受精能力等是人工授粉的關(guān)鍵。作者近年的野外觀察結(jié)果表明，大別山五針?biāo)傻膫鞣圻^程易受雨季影響，導(dǎo)致雌球花不易受粉，從而影響結(jié)實。
韓建偉等[5]對大別山五針?biāo)苫ǚ鄣碾x體萌發(fā)能力進行了研究，但目前對如何有效貯藏其花粉以及貯藏溫度對大別山五針?biāo)苫ǚ刍盍Φ挠绊懮胁磺宄?。為此，作者對不同溫度條件下貯藏不同時間的大別山五針?biāo)傻幕ǚ刍盍M行了測定，以期篩選出適宜于較長時間保存大別山五針?biāo)苫ǚ鄣臏囟葪l件，為解決大別山五針?biāo)蓚鞣燮诨ǚ鄄蛔銌栴}及其人工授粉和種質(zhì)資源保存技術(shù)的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
1材料和方法
1.1材料
供試大別山五針?biāo)苫ǚ塾?013年5月13日(盛粉期)采自安徽省岳西縣大王溝的栽培植株，取新鮮不黏手的花粉進行實驗。
1.2方法
1.2.1花粉貯藏條件設(shè)置輕取雄球花并放入紙袋內(nèi)，自然干燥后去除雜質(zhì)，分裝至具塞小瓶中并放入適量的硅膠，分別置于室溫(2013年5月份、 9月份和10月份的平均氣溫為20 ℃；6月份的平均氣溫為25 ℃；7月份和8月份的平均氣溫為28 ℃)、4 ℃和-20 ℃條件下貯藏，分別于貯藏1、3、5、7、9、11、15、20、30、60、75、115和170 d時取樣觀察花粉活力。
1.2.2花粉活力測定采用MTT染色法[6]測定花粉活力。在載玻片上滴1滴質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.5%MTT溶液，取適量花粉與其混合，加蓋玻片后室溫放置15 min；用BM2000顯微鏡(江南永新光學(xué)有限公司)觀察花粉的染色情況，有活力花粉呈藍(lán)色，無活力花粉未染色。每個處理選擇染色均勻的區(qū)域鏡檢6個視野，各重復(fù)3次。
1.3數(shù)據(jù)處理與分析
按照公式“花粉活力=(染色花粉粒數(shù)/花粉?？倲?shù))×100%”計算花粉活力。采用EXCEL 2003軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理。
2結(jié)果和分析
在室溫、4 ℃和-20 ℃條件下分別貯藏1、3、5、7、9、11、15、20、30、60、75、115和170 d的大別山五針?biāo)苫ǚ刍盍ψ兓姳?。結(jié)果顯示：在不同溫度條件下，大別山五針?biāo)傻幕ǚ刍盍S貯藏時間的延長而逐漸降低。貯藏1 d時，貯藏于不同溫度下的花粉活力均較高，平均花粉活力為95.97%；貯藏3和5 d時， 貯藏于室溫下的花粉活力基本不變， 但貯藏于4 ℃和-20 ℃條件下的花粉活力略降低；貯藏7 d后，貯藏于不同溫度下的花粉仍保持較高活力，在室溫、4 ℃和-20 ℃條件下平均花粉活力分別為95.62%、93.69%和92.35%；貯藏60 d時，室溫貯藏的花粉活力降幅最大，平均花粉活力降至72.93%，而4 ℃和-20 ℃條件下平均花粉活力分別降至83.75%和83.90%；貯藏60 d后，在室溫條件下的花粉活力急劇下降，在-20 ℃條件下的花粉活力也明顯下降，貯藏75 d時平均花粉活力分別降至40.33%和73.33%，而4 ℃條件下平均花粉活力仍保持81.67%；貯藏115 d時，不同貯藏溫度下平均花粉活力均急劇下降，其中4 ℃條件下平均花粉活力降至18.11%，而室溫下平均花粉活力僅為5.68%；貯藏170 d時，各貯藏條件下花粉均無活力。
貯藏溫度Storagetemperature不同貯藏時間的花粉活力/% Pollenviabilityatdifferentstoragetimes1d3d5d7d9d11d15d室溫Roomtemperature95.97±0.5395.96±0.6495.95±0.6595.62±0.2095.34±0.2494.24±1.0794.22±0.344℃95.97±0.5394.85±0.1593.95±0.2793.69±0.2392.99±0.1092.98±0.2190.10±0.17-20℃95.97±0.5394.51±0.2493.48±0.4892.35±0.4391.60±0.4489.07±1.7587.05±1.07
貯藏溫度Storagetemperature不同貯藏時間的花粉活力/% Pollenviabilityatdifferentstoragetimes20d30d60d75d115d170d室溫Roomtemperature93.80±0.4992.91±0.5772.93±1.7140.33±1.295.68±1.740.00±0.004℃85.78±1.0585.11±0.9883.75±0.9981.67±0.8718.11±1.020.00±0.00-20℃85.54±0.9285.42±0.8783.90±1.7373.33±2.3812.07±1.550.00±0.00
3討論和結(jié)論
花粉活力常用的檢測方法為TTC染色法[7-8]。但該方法需要將花粉和染色液在恒溫條件下混合并保溫一段時間，因而操作要求較高。而本研究選用的MTT染色法只需將花粉和染色液混合后置于室溫條件下放置15 min即可檢測出花粉活力，是一種靈敏度高、經(jīng)濟、快速的花粉活力檢測方法，尤其適合野外條件下花粉活力的檢測，該方法已在其他植物花粉活力研究中得到驗證[6]，并被認(rèn)為是與花粉實際萌發(fā)率最為接近的一種花粉活力測定方法[9]。
韓建偉等[5]的研究結(jié)果表明：在最適條件下大別山五針?biāo)呻x體花粉的萌發(fā)率僅為33.15%，遠(yuǎn)低于采用MTT染色法獲得的花粉活力檢測結(jié)果，其原因是離體萌發(fā)研究所用的花粉在采集后需經(jīng)過較長時間的運輸，花粉活力整體降低并可能影響離體萌發(fā)結(jié)果(未發(fā)表數(shù)據(jù))，但是否還有其他因素影響花粉萌發(fā)率，則有待進一步研究。
花粉活力通常隨貯藏時間的延長而降低，并因貯藏方法不同而異[10]。大別山五針?biāo)苫ǚ刍盍σ簿哂型瑯拥淖兓厔荨２杉?dāng)天大別山五針?biāo)苫ǚ刍盍ψ罡?為95.97%)，室溫條件下其花粉活力在貯藏60 d時仍達到72.93%，但室溫條件下貯藏60 d后其花粉活力急劇下降，此時正值7月中旬，較高的室溫可能加速了花粉的呼吸作用，從而使花粉活力快速下降；而在4 ℃條件下貯藏75 d 時大別山五針?biāo)傻幕ǚ刍盍θ暂^高，為81.67%，貯藏115 d時其花粉活力才明顯下降，說明大別山五針?biāo)傻幕ǚ刍盍σ惨蛸A藏條件不同而異。
物種瀕危是多因素共同作用的結(jié)果，其中雄配子發(fā)育異常是很多物種瀕危的重要因素之一[11]。新采集的大別山五針?biāo)苫ǚ刍盍Ω哌_95.97%，表明其雄配子發(fā)育正常。項小燕等[2]的研究結(jié)果表明：大別山五針?biāo)缮⒎燮诔Ｊ艿接昙镜挠绊?，易造成花粉活力下降及花粉密度降低，雌球花受粉不足，這也是大別山五針?biāo)煞N子產(chǎn)量和質(zhì)量均較低的重要原因之一(未發(fā)表數(shù)據(jù))。如果在盛粉期采集花粉并進行適度的人工補充授粉，可提高大別山五針?biāo)傻氖芊勐?，從而提高其種子的產(chǎn)量和質(zhì)量(未發(fā)表數(shù)據(jù))。
綜上所述，室溫最有利于短期(1個月)內(nèi)大別山五針?biāo)苫ǚ鄣谋４?，? ℃貯藏則更有利于較長時間保持其花粉活力。此外，不同溫度條件下貯藏7 d內(nèi)大別山五針?biāo)傻幕ǚ刍盍鶡o明顯降低，為該種的人工授粉提供了可能性。
參考文獻：
[1]彭鎮(zhèn)華, 江澤慧. 大別山五針?biāo)杉捌鹪碵M]. 北京： 中國林業(yè)出版社, 1999.
[2]項小燕, 張小平, 段仁燕, 等. 瀕危植物大別山五針?biāo)赡笜淞只ǚ蹅鞑ヒ?guī)律[J]. 廣西植物, 2014, 34(3): 333-337.
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(責(zé)任編輯: 郭嚴(yán)冬)
收稿日期：2015-08-25
基金項目：國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201304314)； 安徽省教育廳自然科學(xué)重點項目(KJ2016A437)
作者簡介：項小燕(1981—)，女，安徽桐城人，博士，副教授，主要從事植物系統(tǒng)進化及植物資源保護等方面的研究。 ①通信作者E-mail: wugl@sina.cn
中圖分類號：Q945.78; S791.24
文獻標(biāo)志碼：A
文章編號：1674-7895(2016)02-0114-03
DOI：10.3969/j.issn.1674-7895.2016.02.15
Change in pollen viability ofPinusdabeshanensisat different storage temperatures
XIANG Xiaoyan, WU Ganlin①, DUAN Renyan, WANG Zhigao, ZHANG Zhongxin, WANG Guangyan
(School of Life Sciences, Anqing Normal University, Anqing 246133, China),J.PlantResour. &Environ., 2016, 25(2): 114-116
Key words:Pinus dabeshanensis C. Y. Cheng et Y. W. Law; storage temperature; storage time; pollen viability; MTT staining method
Abstract:By means of MTT staining method, pollen viability of Pinus dabeshanensis C. Y. Cheng et Y. W. Law stored for 1-170 d under conditions of room temperature (20 ℃-28 ℃), 4 ℃ and -20 ℃ was measured. The result shows that pollen viability of P. dabeshanensis is 95.97% during pollen flourishing period. When storage for 7 d at different temperatures, pollen viability is still over 90%. Pollen viability decreases to 40.33% when storage for 75 d at room temperature, while that decreases to 81.67% and 73.33% when storage for 75 d at 4 ℃ and -20 ℃, respectively. But when storage for 115 d at different temperatures, pollen viability is lower than 20%. It is indicated that short-term (one month) storage at room temperature is suitable to keep pollen viability of P. dabeshanensis, but 4 ℃ is more suitable for keeping pollen viability for longer time.
項小燕, 吳甘霖, 段仁燕, 王志高, 張中信, 王廣艷
(安慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 安徽 安慶246133)
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不同貯藏溫度下大別山五針?biāo)苫ǚ刍盍Φ淖兓?/p>
項小燕, 吳甘霖①, 段仁燕, 王志高, 張中信, 王廣艷
(安慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 安徽 安慶246133)
關(guān)鍵詞：大別山五針?biāo)? 貯藏溫度; 貯藏時間; 花粉活力; MTT染色法
大別山五針?biāo)?PinusdabeshanensisC. Y. Cheng et Y. W. Law)為松科(Pinaceae)松屬(PinusLinn.)植物，自然種群數(shù)量極少，目前僅發(fā)現(xiàn)在安徽省岳西縣大王溝海拔900～1 300 m陰坡和半陰坡有相對集中的分布，種群規(guī)模計200余株，且多為成年個體，林下幼苗極少，自然更新困難，為中國特有珍稀樹種之一[1]。大別山五針?biāo)沙Ｔ诿磕?月份至4月份形成花芽，5月中下旬花粉成熟并散發(fā)，花粉具氣囊，此時雌球花張開接受傳粉，球果翌年9月成熟[2]。據(jù)作者近年的調(diào)查，大別山五針?biāo)煞N子敗育率較高，且種子質(zhì)量較低，這也是該種類瀕危的重要原因之一。
花粉為雄配子體，其活力和壽命對授粉、受精、種子產(chǎn)量和質(zhì)量具有直接影響[3]；花粉活力主要受植物自身遺傳特性和外界因素的影響，尤其受溫度的影響[4]；而花粉的貯藏、活力以及受精能力等是人工授粉的關(guān)鍵。作者近年的野外觀察結(jié)果表明，大別山五針?biāo)傻膫鞣圻^程易受雨季影響，導(dǎo)致雌球花不易受粉，從而影響結(jié)實。
韓建偉等[5]對大別山五針?biāo)苫ǚ鄣碾x體萌發(fā)能力進行了研究，但目前對如何有效貯藏其花粉以及貯藏溫度對大別山五針?biāo)苫ǚ刍盍Φ挠绊懮胁磺宄?。為此，作者對不同溫度條件下貯藏不同時間的大別山五針?biāo)傻幕ǚ刍盍M行了測定，以期篩選出適宜于較長時間保存大別山五針?biāo)苫ǚ鄣臏囟葪l件，為解決大別山五針?biāo)蓚鞣燮诨ǚ鄄蛔銌栴}及其人工授粉和種質(zhì)資源保存技術(shù)的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
1材料和方法
1.1材料
供試大別山五針?biāo)苫ǚ塾?013年5月13日(盛粉期)采自安徽省岳西縣大王溝的栽培植株，取新鮮不黏手的花粉進行實驗。
1.2方法
1.2.1花粉貯藏條件設(shè)置輕取雄球花并放入紙袋內(nèi)，自然干燥后去除雜質(zhì)，分裝至具塞小瓶中并放入適量的硅膠，分別置于室溫(2013年5月份、 9月份和10月份的平均氣溫為20 ℃；6月份的平均氣溫為25 ℃；7月份和8月份的平均氣溫為28 ℃)、4 ℃和-20 ℃條件下貯藏，分別于貯藏1、3、5、7、9、11、15、20、30、60、75、115和170 d時取樣觀察花粉活力。
1.2.2花粉活力測定采用MTT染色法[6]測定花粉活力。在載玻片上滴1滴質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.5%MTT溶液，取適量花粉與其混合，加蓋玻片后室溫放置15 min；用BM2000顯微鏡(江南永新光學(xué)有限公司)觀察花粉的染色情況，有活力花粉呈藍(lán)色，無活力花粉未染色。每個處理選擇染色均勻的區(qū)域鏡檢6個視野，各重復(fù)3次。
1.3數(shù)據(jù)處理與分析
按照公式“花粉活力=(染色花粉粒數(shù)/花粉?？倲?shù))×100%”計算花粉活力。采用EXCEL 2003軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理。
2結(jié)果和分析
在室溫、4 ℃和-20 ℃條件下分別貯藏1、3、5、7、9、11、15、20、30、60、75、115和170 d的大別山五針?biāo)苫ǚ刍盍ψ兓姳?。結(jié)果顯示：在不同溫度條件下，大別山五針?biāo)傻幕ǚ刍盍S貯藏時間的延長而逐漸降低。貯藏1 d時，貯藏于不同溫度下的花粉活力均較高，平均花粉活力為95.97%；貯藏3和5 d時， 貯藏于室溫下的花粉活力基本不變， 但貯藏于4 ℃和-20 ℃條件下的花粉活力略降低；貯藏7 d后，貯藏于不同溫度下的花粉仍保持較高活力，在室溫、4 ℃和-20 ℃條件下平均花粉活力分別為95.62%、93.69%和92.35%；貯藏60 d時，室溫貯藏的花粉活力降幅最大，平均花粉活力降至72.93%，而4 ℃和-20 ℃條件下平均花粉活力分別降至83.75%和83.90%；貯藏60 d后，在室溫條件下的花粉活力急劇下降，在-20 ℃條件下的花粉活力也明顯下降，貯藏75 d時平均花粉活力分別降至40.33%和73.33%，而4 ℃條件下平均花粉活力仍保持81.67%；貯藏115 d時，不同貯藏溫度下平均花粉活力均急劇下降，其中4 ℃條件下平均花粉活力降至18.11%，而室溫下平均花粉活力僅為5.68%；貯藏170 d時，各貯藏條件下花粉均無活力。
貯藏溫度Storagetemperature不同貯藏時間的花粉活力/% Pollenviabilityatdifferentstoragetimes1d3d5d7d9d11d15d室溫Roomtemperature95.97±0.5395.96±0.6495.95±0.6595.62±0.2095.34±0.2494.24±1.0794.22±0.344℃95.97±0.5394.85±0.1593.95±0.2793.69±0.2392.99±0.1092.98±0.2190.10±0.17-20℃95.97±0.5394.51±0.2493.48±0.4892.35±0.4391.60±0.4489.07±1.7587.05±1.07
貯藏溫度Storagetemperature不同貯藏時間的花粉活力/% Pollenviabilityatdifferentstoragetimes20d30d60d75d115d170d室溫Roomtemperature93.80±0.4992.91±0.5772.93±1.7140.33±1.295.68±1.740.00±0.004℃85.78±1.0585.11±0.9883.75±0.9981.67±0.8718.11±1.020.00±0.00-20℃85.54±0.9285.42±0.8783.90±1.7373.33±2.3812.07±1.550.00±0.00
3討論和結(jié)論
花粉活力常用的檢測方法為TTC染色法[7-8]。但該方法需要將花粉和染色液在恒溫條件下混合并保溫一段時間，因而操作要求較高。而本研究選用的MTT染色法只需將花粉和染色液混合后置于室溫條件下放置15 min即可檢測出花粉活力，是一種靈敏度高、經(jīng)濟、快速的花粉活力檢測方法，尤其適合野外條件下花粉活力的檢測，該方法已在其他植物花粉活力研究中得到驗證[6]，并被認(rèn)為是與花粉實際萌發(fā)率最為接近的一種花粉活力測定方法[9]。
韓建偉等[5]的研究結(jié)果表明：在最適條件下大別山五針?biāo)呻x體花粉的萌發(fā)率僅為33.15%，遠(yuǎn)低于采用MTT染色法獲得的花粉活力檢測結(jié)果，其原因是離體萌發(fā)研究所用的花粉在采集后需經(jīng)過較長時間的運輸，花粉活力整體降低并可能影響離體萌發(fā)結(jié)果(未發(fā)表數(shù)據(jù))，但是否還有其他因素影響花粉萌發(fā)率，則有待進一步研究。
花粉活力通常隨貯藏時間的延長而降低，并因貯藏方法不同而異[10]。大別山五針?biāo)苫ǚ刍盍σ簿哂型瑯拥淖兓厔荨２杉?dāng)天大別山五針?biāo)苫ǚ刍盍ψ罡?為95.97%)，室溫條件下其花粉活力在貯藏60 d時仍達到72.93%，但室溫條件下貯藏60 d后其花粉活力急劇下降，此時正值7月中旬，較高的室溫可能加速了花粉的呼吸作用，從而使花粉活力快速下降；而在4 ℃條件下貯藏75 d 時大別山五針?biāo)傻幕ǚ刍盍θ暂^高，為81.67%，貯藏115 d時其花粉活力才明顯下降，說明大別山五針?biāo)傻幕ǚ刍盍σ惨蛸A藏條件不同而異。
物種瀕危是多因素共同作用的結(jié)果，其中雄配子發(fā)育異常是很多物種瀕危的重要因素之一[11]。新采集的大別山五針?biāo)苫ǚ刍盍Ω哌_95.97%，表明其雄配子發(fā)育正常。項小燕等[2]的研究結(jié)果表明：大別山五針?biāo)缮⒎燮诔Ｊ艿接昙镜挠绊?，易造成花粉活力下降及花粉密度降低，雌球花受粉不足，這也是大別山五針?biāo)煞N子產(chǎn)量和質(zhì)量均較低的重要原因之一(未發(fā)表數(shù)據(jù))。如果在盛粉期采集花粉并進行適度的人工補充授粉，可提高大別山五針?biāo)傻氖芊勐?，從而提高其種子的產(chǎn)量和質(zhì)量(未發(fā)表數(shù)據(jù))。
綜上所述，室溫最有利于短期(1個月)內(nèi)大別山五針?biāo)苫ǚ鄣谋４?，? ℃貯藏則更有利于較長時間保持其花粉活力。此外，不同溫度條件下貯藏7 d內(nèi)大別山五針?biāo)傻幕ǚ刍盍鶡o明顯降低，為該種的人工授粉提供了可能性。
參考文獻：
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(責(zé)任編輯: 郭嚴(yán)冬)
收稿日期：2015-08-25
基金項目：國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201304314)； 安徽省教育廳自然科學(xué)重點項目(KJ2016A437)
作者簡介：項小燕(1981—)，女，安徽桐城人，博士，副教授，主要從事植物系統(tǒng)進化及植物資源保護等方面的研究。 ①通信作者E-mail: wugl@sina.cn
中圖分類號：Q945.78; S791.24
文獻標(biāo)志碼：A
文章編號：1674-7895(2016)02-0114-03
DOI：10.3969/j.issn.1674-7895.2016.02.15
Change in pollen viability ofPinusdabeshanensisat different storage temperatures
XIANG Xiaoyan, WU Ganlin①, DUAN Renyan, WANG Zhigao, ZHANG Zhongxin, WANG Guangyan
(School of Life Sciences, Anqing Normal University, Anqing 246133, China),J.PlantResour. &Environ., 2016, 25(2): 114-116
Key words:Pinus dabeshanensis C. Y. Cheng et Y. W. Law; storage temperature; storage time; pollen viability; MTT staining method
Abstract:By means of MTT staining method, pollen viability of Pinus dabeshanensis C. Y. Cheng et Y. W. Law stored for 1-170 d under conditions of room temperature (20 ℃-28 ℃), 4 ℃ and -20 ℃ was measured. The result shows that pollen viability of P. dabeshanensis is 95.97% during pollen flourishing period. When storage for 7 d at different temperatures, pollen viability is still over 90%. Pollen viability decreases to 40.33% when storage for 75 d at room temperature, while that decreases to 81.67% and 73.33% when storage for 75 d at 4 ℃ and -20 ℃, respectively. But when storage for 115 d at different temperatures, pollen viability is lower than 20%. It is indicated that short-term (one month) storage at room temperature is suitable to keep pollen viability of P. dabeshanensis, but 4 ℃ is more suitable for keeping pollen viability for longer time.
