周　媛　薛艷紅　劉朝霞

(1. 西安外事學院 醫(yī)學院， 西安　710077； 2. 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室(三峽大學)， 湖北 宜昌　443002)

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木欖提取物及單體化合物對SH-SY5Y神經(jīng)細胞抗氧化研究

周媛1，2薛艷紅2劉朝霞2

(1. 西安外事學院 醫(yī)學院， 西安710077； 2. 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室(三峽大學)， 湖北 宜昌443002)

摘要：研究了中國海南紅樹植物木欖提取物及其單體化合物對SH-SY5Y神經(jīng)細胞的抗氧化作用．對木欖成分提取分離、結構鑒定后，用H2O2處理人神經(jīng)瘤母細胞(SH-SY5Y細胞)，建立細胞損傷模型，以MTT法檢測木欖提取物及單體化合物的細胞增殖作用與抗氧化活性．結果表明木欖乙醇提取物、石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位及部分單體化合物能很好地對抗H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷．單體化合物在低劑量(1.25～5 μg·mL-1)時量效關系良好，隨著濃度的增加，對SH-SY5Y細胞的抗氧化作用逐漸增強．木欖能能很好地對抗H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷，對SH-SY5Y細胞具有顯著的抗氧化作用，該作用與減少胞內(nèi)氧自由基有關，其機制有待進一步研究．

關鍵詞：木欖；SH-SY5Y細胞；H2O2；抗氧化

木欖Bruguieragymnorhiza(L.) Savigny，為紅樹科(Rhizophoraceae)木欖屬(BruguieraLamk)植物．木欖生長于海岸沖積帶的紅樹林中，國內(nèi)外均有分布．我國廣東、廣西、福建、臺灣等省及其沿海島嶼為國內(nèi)主要分布地．木欖作為海洋藥用植物，已收載于《臺灣藥用植物志》、《海洋藥物》、《現(xiàn)代本草綱目》等中草藥專著中[1]．民族藥理學認為木欖具有清熱解毒、止瀉、收斂、止血及截瘧等功效．但木欖對神經(jīng)細胞的抗氧化作用方面的研究迄今為止未見相關報道．

1材料與方法

1.1試驗藥物

木欖，2009年10月采自中國海南島，由中國暨南大學藥學院吳軍教授鑒定為紅樹科木欖屬植物木欖Bruguieragymnorhiza(L.) Savigny．原植物標本存放于天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室(三峽大學)，樣品編號為BGSANYA200910．木欖(12 kg)，自然干燥，粉碎，室溫下以95%乙醇浸提5次，提取液濃縮得浸膏(0.5 kg)．不同極性有機溶劑萃取，得石油醚部位22.5 g，乙酸乙酯部位20.0 g，正丁醇部位125.0 g．石油醚部位和乙酸乙酯部位通過各種柱層析并結合HPLC分離純化，得到單體化合物：油酸(BGP-1)、β-谷甾醇(BGP-2)、大黃素甲醚(BGP-3)、Mansonone H(BGP-4)、腦苷脂B(BGP-5)、Populene A(BGP-10)、3，4，5-三甲氧基苯甲酸(BGE-3a)和3，4-二甲氧基苯甲酸(BGE-3b)、咖啡酸(BGE-9)、大黃酸(BGE-10)，均為已知化合物，其光譜數(shù)據(jù)與文獻報道一致．各萃取部位及單體化合物以DMSO/無水乙醇混合溶液溶解，制成儲備液，0.22 μm濾器過濾除菌，4℃保存．臨用時以DMEM/F-12給藥培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，并使DMSO終濃度不超過0.1%，無水乙醇終濃度不超過1%．

1.2細胞株

人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y系(華中科技大學實驗動物中心提供，三峽大學天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室傳代保藏)．

1.3試劑

DMEM/F-12培養(yǎng)基，上海滬鼎生物科技有限公司；胰蛋白酶，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；MTT、DMSO，美國Sigma公司；新生胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；青霉素、鏈霉素，華北制藥集團公司；NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaHCO3、H2O2等，北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術有限公司．

1.4培養(yǎng)基及試液配制

DMEM/F-12培養(yǎng)基配制：DMEM/F-12培養(yǎng)基粉末1包，溶于950 mL重蒸餾水中，混勻，加2.2 g NaHCO3，溶解后加重蒸餾水定容至1 000 mL，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，于4℃保存．

DMEM/F-12完全培養(yǎng)基配制：DMEM/F-12培養(yǎng)基中加入100 U·mL-1鏈霉素，100 U·mL-1青霉素，10%新生胎牛血清．

DMEM/F-12給藥培養(yǎng)基配制：DMEM/F-12培養(yǎng)基中加入100 U·mL-1鏈霉素，100 U·mL-1青霉素，3%新生胎牛血清．

DMEM/F-12造模培養(yǎng)基：DMEM/F-12培養(yǎng)基中加入100 U·mL-1鏈霉素，100 U·mL-1青霉素．

0.01 mol·L-1PBS溶液：精密稱取NaCl 8.00 g，KCl 0.20 g，Na2HPO4 2.89 g，KH2PO40.20 g，加重蒸餾水溶解，滴加1 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值為6.8～7.0，加重蒸餾水定容至1 000 mL，分裝，121℃滅菌30 min，冷卻后于4℃保存．

青/鏈霉素溶液：取青霉素(80萬單位/瓶)1瓶，鏈霉素(100萬單位/瓶)1瓶，分別用注射器加入重蒸餾水溶解使成每毫升各含20萬單位的溶液．分取4 mL青霉素溶液和4 mL鏈霉素溶液置盛有32 mL重蒸餾水的燒杯中，混勻配制成2萬單位/mL的青/鏈霉素溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，于-20℃保存．臨用時按每100 mL培養(yǎng)基加0.5 mL青/鏈霉素溶液的比例使用．

MTT溶液：精密稱取MTT粉末0.250 g，加入到45 mL 0.01 mol·L-1PBS溶液中，溶解，混勻，加0.01 mol·L-1PBS溶液定容至50 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，于4℃避光保存．

0.25%胰酶溶液：精密稱取胰酶0.250 g，加90 mL 0.01 mol·L-1的PBS充分溶解后定容至100 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，分裝，-20℃保存．

H2O2溶液：取市售30% H2O212 μL加入到1 mL雙蒸水中配制成100 mmol·L-1的儲液，0.22 μm微孔濾器過濾除菌，然后用DMEM/F-12造模培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用．

1.5方法

1.5.1SH-SY5Y細胞培養(yǎng)

37℃、5%CO2、飽和濕度孵育箱中，以DMEM/F-12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)．待SH-SY5Y細胞生長至80%～90%匯合時進行傳代，傳代比例為1∶3，用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞．

1.5.2H2O2損傷模型建立與細胞增殖活性篩選[1]

取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞接種于96孔板，接種濃度5×104個/mL，每孔100 μL．培養(yǎng)24 h貼壁后棄去舊培養(yǎng)基，加入不同濃度的試驗藥物，同時設空白組和模型組，空白組、模型組加入DMEM/F-12溶藥培養(yǎng)基，每組設5個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去舊培養(yǎng)基，空白對照組加入DMEM/F-12造模培養(yǎng)基，模型組、給藥組加入H2O2溶液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，MTT比色法于492 nm波長處測定吸光度值，計算細胞存活率．

1.5.3單體化合物對SH-SY5Y細胞存活率量效關系實驗[2-4]

照“1.5.2”方法用H2O2造模，加入對神經(jīng)細胞抗氧化作用顯著的木欖單體化合物BGP-1、BGP-3、BGP-4、BGP-5、BGE-9及BGE-10，濃度分別設置為1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 μg·mL-1，MTT比色法檢測化合物對SH-SY5Y細胞存活率的影響，考察其量效關系．

1.5.4統(tǒng)計學處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以x±s表示．

2結果

2.1木欖及單體化合物對H2O2損傷下SH-SY5Y細胞的增殖作用

為明確木欖及其單體化合物對SH-SY5Y神經(jīng)細胞的生長是否具有毒害作用，并確定適宜的藥物濃度范圍，試驗中考察了高低兩種濃度(30 μg·mL-1與3 μg·mL-1)對SH-SY5Y細胞存活率的影響．初篩結果顯示，與模型組相比，木欖乙醇提取物、石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、單體化合物(BGP-1、BGP-3、BGP-4、BGP-5、BGP-10、BGE-9、BGE-10、BGE-3a)均能提高細胞存活率，提取物中以乙醇提取物及石油醚萃取物增殖活性更好，單體化合物中以BGP-1、BGP-3、BGP-4、BGP-5、BGE-9及BGE-10增殖效果更好，表明木欖在一定程度上保護細胞免于遭到雙氧水的氧化損傷，具有明顯的對神經(jīng)細胞的抗氧化作用．見表1和表2．

表1　各提取物對H2O2致神經(jīng)細胞損傷的影響

續(xù)表1　各提取物對H2O2致神經(jīng)細胞損傷的影響±s，n=6)

注：各提取物的藥量根據(jù)得率折算成原生藥為40、80 g·kg-1．

表2　單體化合物對H2O2致神經(jīng)細胞損傷的影響±s，n=8)

注：與模型組相比*P<0.05，**P<0.01．

2.2單體化合物對H2O2損傷下SH-SY5Y細胞抗氧化的量效關系

木欖單體化合物對神經(jīng)細胞抗氧化的量效關系結果見表3．從結果可看出，BGP-1、BGP-3、BGP-4、BGP-5、BGE-9及BGE-10這6種單體化合物對神經(jīng)細胞的保護作用趨勢，與“2.1”結果一致．BGP-5能很好地對抗H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷，效果顯著，細胞存活率可達100%左右，接近空白組．進一步分析發(fā)現(xiàn)，各化合物的量效關系并不具一致的規(guī)律性，僅BGP-3隨著濃度的增加，其抗氧化活性亦增加；但在較低濃度(1.25～5 μg/mL)時，多表現(xiàn)出良好的劑量依賴關系，即抗氧化作用隨藥物濃度增加而增強；高劑量時各化合物對抗H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷的作用不再增強．

表3　藥物對H2O2致神經(jīng)細胞損傷的影響

注：與模型組相比*P<0.05，**P<0.01．

3討論

在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生中，氧化應激是重要的致病因素[5]．目前評價最多的神經(jīng)保護藥物是電壓和受體介導的鈣通道拮抗劑和直接抑制氧自由基介導細胞損傷的抗氧化劑[6]．本文采用MTT法，用H2O2處理SH-SY5Y細胞，建立細胞損傷模型，篩選木欖提取物及單體化合物對SH-SY5Y神經(jīng)細胞的抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)木欖的乙醇提取物、石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位及部分單體化合物能很好地對抗H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷，提高細胞存活率．特別是BGP-5，與模型組相比，在劑量為1.25～10.00 μg·mL-1(1.48～11.86 μmol·L-1)時，細胞存活率提高了約100%，表明隨著藥物濃度的增加，其對神經(jīng)細胞的抗氧化作用逐漸增強．在較低濃度(1.25～5 μg·mL-1)時，單體化合物多表現(xiàn)出良好的劑量依賴關系，即抗氧化作用隨藥物濃度增加而增強具有良好的量效關系，但高劑量時化合物對抗H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷的作用不再增強．木欖對神經(jīng)細胞的抗氧化作用與減少胞內(nèi)氧自由基有關，其機制可能與升高抗氧化物酶或降低炎性介質有關．其具體機制有待進一步研究．

參考文獻：

[1]曾文，畢玉婷，孔玉珊，等．吉祥草中5種提取物對神經(jīng)細胞的抗氧化活性研究[J]．時珍國醫(yī)國藥，2014(7)：1549-1551．

[2]吳迪，吳桂榮，阿布力孜·阿布杜拉，等．不同-3/-6構成比的配伍紅花籽油對SH-SY5Y細胞氧化損傷的預防效應[J]．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2011(3)：420-422．

[3]孫芳玲，王文，安宜，等．莫諾苷抑制過氧化氫誘導的神經(jīng)細胞損傷作用[J]．中國藥物與臨床，2008(11)：843-845．

[4]余涓，胡桂芳，翁繩美，等．13-甲基十四烷酸對H2O2誘導SH-SY5Y神經(jīng)細胞損傷的保護作用[J]．中國臨床藥理學與治療學，2010(6)：622-626．

[5]馬麗君，曹池，田建英，等．維生素E對神經(jīng)細胞氧化應激損傷的保護作用[J]．寧夏醫(yī)科大學學報，2012(8)：768-770．

[6]鐘廣英，付曉珍，張葉軍，等．植物多糖對神經(jīng)細胞的保護作用[J]．生物技術通訊，2014(6)：893-895．

[責任編輯周文凱]

收稿日期：2015-12-16

基金項目：國家自然科學基金項目(31540065)；天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室開放基金(2015NP03)；三峽大學人才啟動基金項目(KJ2009B001)

通信作者：劉朝霞(1977-)，女，副教授，博士，研究方向天然產(chǎn)物開發(fā)與活性研究．E-mail： bosliu2009@163.com

DOI：10.13393/j.cnki.issn.1672-948X.2016.02.020

中圖分類號：

文獻標識碼：A

文章編號：1672-948X(2016)02-0088-04

Antioxidation ofBruguieraGymnorrhizaExtracts and Its Compounds on SH-SY5Y Cells

Zhou Yuan1,2Xue Yanhong2Liu Zhaoxia2

(1. Medical College, Xi'an International Univ., Xi'an 710077, China；2. Hubei Key Laboratory of Natural Products Research & Development, China Three Gorges Univ., Yichang 443002, China)

AbstractTo investigate antioxidation of the Chinese Hainan mangrove plant，Bruguiera gymnorrhiza, the compounds were isolated and purified with silica column chromatography and sephadex LH-20 column chromatography and HPLC methods. Their structures were identified by physicochemical analysis，spectroscopic analysis (1H-NMR，13C-NMR and MS). After extraction and purification，H2O2 oxidative damage model to human neuroblastoma strains SH-SY5Y cells was established; and then the cell toxicity and the antioxidation under oxidative stress were evaluated by MTT method． The ethanol extract, petroleum ether extract and ethyl acetate extract of B. gymnorrhiza showed better antioxidant activities for SH-SY5Y cells. Among the compounds oleic acid (BGP-1), physcion (BGP-3), Mansonone H (BGP-4), Catacerebroside B (BGP-5), caffeic acid (BGE-9) and rhein (BGE-10) had more significant protective effects and showed the dose-dependent effect at the low concentrations (1.25-5 μg/mL). It is concluded that the B. gymnorrhiza can be developed as a potential drug for neurodegenerative diseases．

KeywordsB. gymnorhiza;SH-SY5Y cell;H2O2;antioxidation