賀澤峰，王曉霞，郭貴寶，王正德，閆 慧

更昔洛韋與DNA分子相互作用的紫外光譜研究

賀澤峰，王曉霞，郭貴寶，王正德，閆 慧

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

在不同濃度、時(shí)間、pH等條件下，利用紫外分光光度法研究更昔洛韋（GCV）與鮭魚精DNA的相互作用。結(jié)果表明，鮭魚精DNA紫外吸收值隨溶液中GCV濃度的增加而增加；在pH=4.0～9.0條件下，GCV與DNA大分子以槽溝式結(jié)合。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用雙倒數(shù)分析法計(jì)算出GCV與鮭魚精 DNA相互作用的結(jié)合常數(shù)為KDNA-GCV=6.51×102mL·mg-1。

鮭魚精DNA；紫外光譜；更昔洛韋

脫氧核糖核酸（DNA，Deoxyribonucleic acid），又稱去氧核糖核酸，是生物體的重要組成物質(zhì)，也是遺傳信息的載體和基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)，它在生物體的生長、發(fā)育和繁殖等生命活動(dòng)過程中具有十分重要的作用［1］。DNA與藥物分子相互作用的研究對(duì)探討生命過程的機(jī)制、DNA生物傳感器的研制、DNA藥物的設(shè)計(jì)與合成以及藥物抗病機(jī)制的研究都具有重要的意義［2］。在醫(yī)學(xué)中，也經(jīng)常將DNA與小分子物質(zhì)相互作用，用以研究和闡明抗腫瘤、抗病毒以及致癌致病機(jī)制，同時(shí)也為新型藥物設(shè)計(jì)合成以及藥物體外篩選提供理論支持［3］。因此，研究DNA與藥物小分子的相互影響，對(duì)于理解其物理和生物機(jī)制都具有非常重要的科學(xué)意義。

更昔洛韋（丙氧鳥苷，GCV，DHPG），別名賽美維、麗科偉，化學(xué)名9-（1，3-二羥基-2-丙氧甲基）鳥嘌呤，是一種新的核苷酸嘌呤類抗病毒藥物，臨床上用于預(yù)防和治療巨細(xì)胞病毒感染。但是該藥物毒性大，僅限于治療嚴(yán)重免疫功能并發(fā)的巨細(xì)胞病毒感染，如艾滋病患者、接受化療的腫瘤患者、使用免疫抑制劑的器官移植病人等［4］。我們?cè)诓煌瑵舛?、時(shí)間、pH等條件下，利用紫外分光光度法研究更昔洛韋（GCV）與鮭魚精DNA的相互作用，通過系列實(shí)驗(yàn)，旨在對(duì)GCV的理化性質(zhì)和與DNA的作用原理有一個(gè)全面的認(rèn)識(shí)，進(jìn)而對(duì)GCV在臨床上治療免疫功能并發(fā)的巨細(xì)胞病毒感染提供必要的理論支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

試劑：Tris（分析純），濃鹽酸（分析純），NaCl（分析純），鮭魚精DNA，更昔洛韋，GCV。

用PHS-25C pH檢測(cè)計(jì)配制pH為2.01、3.00、4.06、5.02、6.01、7.01、8.01、9.05的Tris-HCl溶液。

將鮭魚精DNA用濃度為0.05mol·L-1的NaCl溶液配成DNA溶液，置于4℃下保存，用260nm處的吸光度與280nm處的吸光度比值檢驗(yàn)DNA純度，A260/A280＞1.83則符合要求。紫外分光光度計(jì)在260nm處檢測(cè)的DNA濃度為1111μg·mL-1。

用電子天平稱取一定量的GCV，用pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液配制成濃度為1.0×10-4mol·L-1的工作液。

紫外分光光度計(jì)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，濃度為0.21mg·mL-1的鮭魚精DNA，1.0×10-4mol·L-1的GCV的紫外吸收值在0.434左右，誤差最小。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GCV濃度遞增與固定濃度DNA的反應(yīng)

準(zhǔn)備9支干凈的10mL試管，每個(gè)試管均加入濃度為0.21mg·mL-1的DNA工作液1mL，從第1個(gè)試管到第9個(gè)試管依次加入0、0.5、1.0、1.5……4mL的濃度為1.0×10-4mol·L-1的GCV工作液，然后定容到10mL。靜置反應(yīng)一段時(shí)間之后，以二次蒸餾水為參比，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)GCV和鮭魚精DNA的混合溶液。

1.2.2 DNA工作液濃度遞增與固定濃度GCV的反應(yīng)

準(zhǔn)備9支干凈的10mL試管，每個(gè)試管均加入1mL濃度為1.0×10-4mol·L-1的GCV溶液，從第1個(gè)試管到第9個(gè)試管依次加入0、1、2、3……8mL的濃度為0.21mg·m L-1的DNA工作液，然后定容到10mL。靜置反應(yīng)一段時(shí)間之后，以二次蒸餾水為參比，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)GCV和鮭魚精DNA的混合溶液。

1.2.3 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響

準(zhǔn)備1支干凈的10mL試管，試管內(nèi)加入1mL濃度為0.21mg·mL-1的DNA工作液和1mL濃度為1.0×10-4mol·L-1的GCV溶液，然后定容到10mL。以二次蒸餾水為參比，將混合溶液用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，完后將被檢測(cè)液再倒入原10mL試管，反應(yīng)時(shí)間為0、4、8、12、16、20、24、28、32、42min，即每隔4min測(cè)量1次，待到反應(yīng)32min檢測(cè)完之后，隔10min測(cè)量1次即可。

1.2.4 不同pH值對(duì)反應(yīng)體系的影響

準(zhǔn)備9支干凈的10mL試管，每個(gè)試管均加入1mL濃度為1.0×10-4mol·L-1的GCV溶液和濃度為0.21mg·mL-1的DNA工作液1mL，第1個(gè)試管不加Tris-HCl緩沖溶液，從第2個(gè)試管開始依次加入2mL的pH為2.01～9.05的Tris-HCl緩沖溶液，然后定容到10mL。以二次蒸餾水為參比，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)GCV和鮭魚精DNA的混合溶液在不同pH值條件下的紫外光譜。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 GCV與DNA工作液反應(yīng)的紫外光譜

圖1是GCV與濃度為0.021mg·mL-1的DNA混合液的紫外吸收光譜。由圖1可見，隨著GCV濃度的增加，DNA紫外吸收光譜的最大吸收峰從0.0038增加到0.3856，增加了0.3818；最大吸收波長從263nm左移到252nm處，藍(lán)移了11nm。

圖1 GCV與0.021mg·mL-1的DNA混合液的紫外吸收光譜

圖2是DNA與濃度為1.0×10-5mol·L-1的GCV混合液的紫外吸收光譜。由圖2可見，隨著DNA工作液濃度的增加，GCV藥物紫外吸收光譜的最大吸收峰從0.1031增加到0.1288，增加了0.0257；最大吸收波長穩(wěn)定在252nm（253nm）處。

圖2 DNA與1.0×10-5mol·L-1的GCV混合液的紫外吸收光譜

紫外吸收光譜圖（圖3）分別為濃度為0.21mg·mL-1的 DNA工作 液（曲 線 a）、1.0× 10-4mol·L-1的GCV（曲線b）以及兩者混合液的吸收曲線（曲線c）。由圖3可見，DNA在波長263nm處有一較大的吸收峰（曲線a），而GCV（曲線b）的最大吸收峰在波長252nm，兩者混合后的吸光度相對(duì)于DNA的吸收，吸光度明顯增大且伴隨藍(lán)移（曲線c，252nm）。實(shí)驗(yàn)證明，根據(jù)紫外吸收值具有疊加效應(yīng)［5-7］，可以得出GCV與DNA發(fā)生了相互作用并形成了復(fù)合物，進(jìn)而改變了DNA原來的紫外吸收性質(zhì)，最終表現(xiàn)為特征峰波長藍(lán)移，強(qiáng)度增加，但又不完全等于單純的a、b曲線疊加。

根據(jù)long［8-10］的理論，小分子與DNA發(fā)生插入式結(jié)合時(shí)，將會(huì)發(fā)生紅移與減色。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GCV與DNA結(jié)合時(shí)呈現(xiàn)的卻是藍(lán)移增色現(xiàn)象。這表明該藥物沒有插入到DNA堿基對(duì)之間的平面中，可能通過氫鍵作用結(jié)合在DNA螺旋結(jié)構(gòu)的大小溝上，也就是說結(jié)合在DNA上的GCV藥物是暴露在溶液中，所以表現(xiàn)為在DNA溶液中隨著GCV濃度的增加，結(jié)合在DNA上藥物物質(zhì)的量也隨之增加，這就必然導(dǎo)致DAN吸收強(qiáng)度的增加（圖3所示）。而GCV在中性條件下的特征峰出現(xiàn)在252nm處，所以隨著GCV物質(zhì)的量的增加必然引起DNA紫外吸收發(fā)生相應(yīng)的藍(lán)移。增色效應(yīng)和減色效應(yīng)是與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型密切相關(guān)的特有光譜性質(zhì)。因此，綜上所述，可得出GCV與DNA的結(jié)合方式為槽溝式，并非插入式。

圖3 DNA、GCV及其兩者混合物的紫外-可見吸收光譜

2.2 更昔洛韋的濃度對(duì)DNA的影響

圖4是DNA紫外吸收峰值隨GCV梯度濃度的變化關(guān)系圖。由圖4可見，DNA的最大吸收值隨GCV藥物與DNA濃度的比值呈線性關(guān)系。根據(jù)文獻(xiàn)［11］的研究觀點(diǎn)，說明GCV與DNA結(jié)合是一配基一受點(diǎn)的結(jié)合方式。根據(jù)雙倒數(shù)公式有［12-13］：

圖4 DNA紫外吸收峰值隨GCV梯度濃度的變化關(guān)系

式中：A0、A分別表示加入DNA前后的藥物紫外吸收值，K表示結(jié)合常數(shù)。

代入實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5），經(jīng)計(jì)算，DNA與濃度為1.0×10-5mol·L-1的GCV相互作用的結(jié)合常數(shù)為KDNA-GCV=6.51×102mL·mg-1，這說明GCV在DNA上存在很多結(jié)合位點(diǎn)。

圖5 DNA與GCV反應(yīng)的雙倒數(shù)曲線

2.3 不同反應(yīng)時(shí)間條件下更昔洛韋與DNA的紫外吸收情況

表1是GCV（1.0×10-5mol·L-1）與DNA（2.1× 10-2mg·mL-1）反應(yīng)后混合溶液紫外吸收值隨時(shí)間變化的情況。由表1可見，隨著時(shí)間的延長，GCV 與DNA在不同時(shí)間上的紫外吸收光譜曲線峰值從0.1061增加到0.1847，總體上升了0.0786。即隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，GCV與DNA相互作用的紫外吸收峰值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。同時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以得出，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到一定時(shí)間（30min左右），混合溶液的紫外吸收值呈現(xiàn)出穩(wěn)定狀態(tài)。如此便說明GCV 與DNA在結(jié)合時(shí)伴隨有擴(kuò)散過程［14-15］。

GCV加入到DNA溶液中時(shí)，GCV與DNA并沒有馬上發(fā)生反應(yīng)，而是呈現(xiàn)出一種擴(kuò)散趨勢(shì)，此時(shí)的DNA并沒有受到GCV藥物分子的影響，對(duì)應(yīng)的DNA特征峰值（263nm）沒有變化；但當(dāng)GCV擴(kuò)散至DNA分子附近時(shí)，GCV藥物與DNA便發(fā)生結(jié)合，在這個(gè)反應(yīng)過程中該反應(yīng)體系的紫外吸收峰值不穩(wěn)定?？赡艿脑蚴荊CV上的基團(tuán)與DNA不斷發(fā)生反應(yīng)，二者相互作用，使得DNA分子上的堿基共軛基團(tuán)受到了GCV的影響，因此表現(xiàn)為紫外吸收光譜中DNA特征峰強(qiáng)度逐漸增加。同時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，GCV與DNA反應(yīng)的速率逐漸下降直至達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。這也說明GCV與DNA的結(jié)合并沒有特異性，而是隨機(jī)的結(jié)合。

表1 GCV與DNA混合溶液在不同反應(yīng)時(shí)間條件下的紫外吸收值

2.4 不同pH條件下更昔洛韋與DNA的相互作用

圖6和圖7是濃度為0.021mg·mL-1的DNA和濃度為1.0×10-5mol·L-1的GCV在不同pH下的紫外吸收光譜曲線。由圖6可見，當(dāng)pH在3.00 和8.00左右時(shí)，有2個(gè)明顯的波峰，其中以pH為8.00左右時(shí)GCV與DNA混合溶液的紫外吸收峰為最大。其變化的總體趨勢(shì)為：2.00～3.00上升，3.00～5.00下降，5.00～8.00上升，8.00～9.00下降。由圖7可見，GCV與DNA相互作用后紫外特征峰波長隨pH值增加，總體呈現(xiàn)紅移，其中以pH值為9.05時(shí)，特征峰波長紅移現(xiàn)象最為明顯，紅移了4nm（從252nm移至256nm），當(dāng)pH在2.01～7.01之間時(shí)，GCV與DNA的相互作用較為穩(wěn)定［16］。

由核酸化學(xué)可知，當(dāng)pH低于4.0或者大于11.0時(shí)，酸堿可引起DNA堿基對(duì)之間的氫鍵變性，致使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。結(jié)合理論，對(duì)圖6、7進(jìn)行分析便可以得出，當(dāng)pH值在8.00左右時(shí)，GCV 與DNA的混合液紫外吸收峰值最大，特征峰波長紅移。

圖6 GCV與DNA相互作用后紫外吸收峰強(qiáng)度隨pH值變化關(guān)系

圖7 GCV與DNA相互作用后紫外特征峰波長隨pH值變化關(guān)系

3 結(jié)論

本文利用紫外光譜法研究了GCV與DNA在不同條件下的相互作用。實(shí)驗(yàn)過程中，通過探究一定的藥物濃度、反應(yīng)時(shí)間以及pH值條件下展開的系列實(shí)驗(yàn)，得到的是GCV并沒有通過嵌插方式結(jié)合到DNA的堿基上而發(fā)生減色紅移，而是有明顯的增色藍(lán)移，這表明GCV是以槽溝式的方式與DNA相互結(jié)合。同時(shí)，利用雙倒數(shù)法求得GCV與鮭魚精DNA相互作用的結(jié)合常數(shù)為6.51×102mL·mg-1，即GCV與DNA已經(jīng)發(fā)生了相互作用。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果還進(jìn)一步得出，生物大分子（DNA）與藥物小分子（GCV）的相互作用受到多方面因素的影響，包括藥物（GCV）的濃度、反應(yīng)時(shí)間和pH值的不同，其中以藥物濃度的影響較為顯著。這就意味著，在生物分子領(lǐng)域，物質(zhì)之間的相互作用力還是以靜電力、范德華力等電磁相互作用為主。

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Study on Interaction of Ganciclovir with DNA by Ultraviolet Spectroscopy

HE Ze-feng， WANG Xiao-xia， GUO Gui-bao， WANG Zheng-de， YAN Hui
（School of Chemistry and Chemical Engineering， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou 014010， China）

At different concentrations， different times and different pH， the interaction between GCV and salmon sperm DNA was studied by UV-visible spectrophotometry. The results showed that UV adsorption values of salmon sperm DNA increased with the increase of GCV concentration. GCV binded DNA’s groove when pH=4.0～9.0. The combination constant between GCV and salmon sperm DNA was calculated by double reciprocal analysis and the combination constant was KDNA-GCV=6.51×102mL/mg.

salmon sperm DNA； UV spectroscopy； ganciclovir

Q 523

A

1671-9905（2016）06-0009-04

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013MS0209）；內(nèi)蒙古高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（NJZZ14160）；內(nèi)蒙古科技大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新基金（2014068）

王曉霞（1984-），女，內(nèi)蒙古包頭市人，講師，碩士，主要從事熒光光譜分析。電話：（0472）5951561；傳真：（0472）5951561；E-mail：wxx572369@163.com

2016-04-19