張純新，徐龍?chǎng)?，?鏡*，何光中

(1.貴州省金沙縣農(nóng)牧局，貴州 金沙 551800;2.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550005)

貴州關(guān)嶺黃牛POMC基因多態(tài)性分析

張純新1，徐龍?chǎng)?，劉 鏡2*，何光中2

(1.貴州省金沙縣農(nóng)牧局，貴州 金沙 551800;2.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550005)

為研究阿片黑皮質(zhì)素前體(POMC)在動(dòng)物采食和能量平衡中的作用，本研究采用DNA測(cè)序技術(shù)，對(duì)關(guān)嶺黃牛92頭個(gè)體的POMC基因的多態(tài)性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在擴(kuò)增片段為870 bp的產(chǎn)物中，發(fā)現(xiàn)138C＞T，430C＞T，644C＞T，668C＞T，693A＞G 5個(gè)突變位點(diǎn)。多態(tài)性結(jié)果顯示，除430C＞T突變位點(diǎn)處于哈代－溫伯格不平衡狀態(tài)(HWE)(P＜0.05)，其余突變位點(diǎn)均處于HWE平衡狀態(tài)(P＞0.05)，5個(gè)突變位點(diǎn)的多肽信息含量(PIC)均為中度多態(tài)。

貴州關(guān)嶺黃牛;POMC基因;多態(tài)性

阿片黑皮質(zhì)素前體(pro－opiomelanocortin，POMC)是一種蛋白質(zhì)前體，于1979年通過(guò)克隆牛的cDNA而被確認(rèn)，它可以加工成多種不同功能的肽類(lèi)激素，包括黑皮質(zhì)素、促脂解素和β－內(nèi)啡肽，它們主要參與采食和能量平衡調(diào)控［1］。POMC基因和其他幾個(gè)食欲控制關(guān)鍵基因如Leptin［2］和Leptin受體［3］，多用于人的一些肥胖癥的檢測(cè)。而牛POMC基因位于1個(gè)與平均日增重和屠宰重相關(guān)的QTL［4］。Buchanan 等［5］利用連鎖作圖的方法將該基因定位于牛11號(hào)染色體上，并且還發(fā)現(xiàn)1個(gè)距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)288 bp的C＞T同義突變，該突變引入了1個(gè)BtsⅠ酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)與牛的屠體重、平均日增重、眼肌面積相關(guān)。張春雷等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在牛POMC基因的3’側(cè)翼區(qū)存在3個(gè)連鎖的SNPs且與6月齡體重和0～6月齡平均日增重顯著相關(guān)。因此POMC基因可能與牛的生長(zhǎng)和體重相關(guān)。本研究檢測(cè)了貴州關(guān)嶺黃牛POMC基因的多態(tài)性，以期為提高貴州關(guān)嶺黃牛生長(zhǎng)性能的育種工作提供分子學(xué)依據(jù)，為全面開(kāi)發(fā)利用貴州關(guān)嶺黃牛的優(yōu)良遺傳資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 92頭貴州關(guān)嶺黃牛全血樣采自貴州省關(guān)嶺縣種群核心保種區(qū)。采取的黃牛全血樣肝素抗凝，放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取 采用蛋白酶K和TaKa-Ra Blood Genome DNA Ex－traction Kit(購(gòu)于北京天根生物公司)提取基因組DNA。

1.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 根據(jù)在Genbank中登錄的牛POMC基因序列(Genbank登錄號(hào):NC－928357)，使用引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)1對(duì)引物，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列信息如表1所示。

表1 POMC基因引物序列信息

PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中2×Taq PCR Master Mix(購(gòu)于北京天根生物公司)10 μL，上下游引物各 1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 6 μL。PCR 反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR產(chǎn)物的測(cè)序 將PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，然后用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒回收擴(kuò)增片段，送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 測(cè)序所得的序列用DNAstart軟件包中的SeqMan對(duì)序列進(jìn)行校對(duì)，用Clustalx程序進(jìn)行同源性比對(duì)?；蛐皖l率、等位基因頻率、雜合度等群體遺傳參數(shù)采用POPGENE生物技術(shù)軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 POMC基因SNP檢測(cè) 貴州關(guān)嶺黃牛POMC基因PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為870 bp，經(jīng)測(cè)序檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)138C＞T，430C＞T，644C＞T，668C＞T，693A ＞G 5個(gè)突變位點(diǎn)，均存在3種基因型。結(jié)果如圖1所示。

圖1 貴州關(guān)嶺黃牛POMC基因的測(cè)序結(jié)果截圖

2.2 貴州關(guān)嶺黃牛POMC基因多態(tài)性分析 由表2可見(jiàn)，5個(gè)變異位點(diǎn)均是雜合子基因型為優(yōu)勢(shì)基因型。138C＞T，430C＞T，644C＞T變異位點(diǎn)C等位基因頻率大于T等位基因，668C＞T變異位點(diǎn)T等位基因頻率大于C等位基因，693A＞G變異位點(diǎn)A等位基因頻率大于G等位基因。X2檢測(cè)結(jié)果表明，除430C＞T變異位點(diǎn)處于HWE不平衡外(P＜0.05)，其他4個(gè)變異位點(diǎn)均處于HWE平衡狀態(tài)(P＞0.05)。5個(gè)變異位點(diǎn)的雜合度(He)介于0.419 1和0.499 8之間，有效等位基因(Ne)介于1.721 5和1.999 1之間，多態(tài)信息含量(PIC)均呈現(xiàn)中度多肽。

表2 貴州關(guān)嶺黃牛POMC基因的多態(tài)性分析

3 討論與結(jié)論

3.1 候選基因法是一種尋找畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀遺傳標(biāo)記的常用方法，它可以直接地研究該基因多態(tài)性與個(gè)體經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)系。本研究通過(guò)測(cè)序方法對(duì)貴州關(guān)嶺黃牛的POMC基因進(jìn)行了多態(tài)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5處變異位點(diǎn)，均具有3種基因型。從進(jìn)化角度看，群體中的遺傳多樣性是歷史的產(chǎn)物［7］，多態(tài)性信息含量和雜合度都是群體內(nèi)遺傳變異的重要度量指標(biāo)，雜合度值越大，群體內(nèi)的遺傳變異就越大。多態(tài)信息含量值衡量基因變異程度高低，Botstein等［8］提出衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標(biāo)，當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，該變異位點(diǎn)為高度多肽，0.25＜PIC＞0.5時(shí)為中度多肽基因座，PIC＜0.25時(shí)為低度多肽。本研究中5個(gè)變異位點(diǎn)的雜合度(He)介于0.419 1和0.499 8之間，多態(tài)信息含量(PIC)介于0.331 3和0.374 9之間，均屬于中度多肽，研究結(jié)果與張春雷等［6］研究結(jié)果相類(lèi)似。根據(jù)HWE平衡定律，如果沒(méi)有選擇、突變和遷移等發(fā)生，在一個(gè)大的隨機(jī)交配群體內(nèi)，等位基因頻率和基因型頻率隨世代的增加而保持不變，本研究中，5個(gè)變異位點(diǎn)中除430C＞T變異位點(diǎn)外其他變異位點(diǎn)均處于HWE平衡狀態(tài)。以上結(jié)果表明關(guān)嶺黃牛POMC基因的遺傳多樣性比較豐富，選擇潛力較大。

3.2 POMC基因的突變會(huì)導(dǎo)致很多疾病的發(fā)生，例如肥胖癥、腎上腺功能障礙以及毛色改變等，這都是由POMC基因不同功能肽的突變或者表達(dá)水平差異所致［9］。張春雷等［6］研究結(jié)果表明，南陽(yáng)牛的POMC基因變異位點(diǎn)與體重具有關(guān)聯(lián)性，因此POMC基因完全可以作為牛生長(zhǎng)性狀的潛在遺傳標(biāo)記。

［1］Nakanishi S，Inoue A，Kita T et al.Nucleotide sequence of cloned cDNA for bovine corticotrophin－beta－lipotropin precursor［J］.Nature，1979，278(5 703):423～427.

［2］Montangue CT，F(xiàn)arooqi IS，Whitehead JP et al.Congenital leptin deficiency is associated with severe early－onset obesity in humans［J］.Nature，1997，387(6 636):903～908.

［3］Clement K，Vaisse C，Lahlou N et al.A mutation in the human leptin receptor gene cause obesity and pituitary dysfunction［J］.Nature，1998，392(6 674):398～401.

［4］Thue TD，Buchanan FC.Linkage mapping of POMC to bovine chromosome 11［J］.Anim Genet，2003，24(2):146～160.

［5］Buchanan FC，Thue TD，Yu P et al.Single nucleotide polymorphisms in the corticotrophin－releasing hormone and pro－opiomelancortin genes are association with growth and carcass yield in beef cattle［J］.Anim Genet，2005，36(2):127～131.

［6］張春雷，王艷紅，陳宏，等.牛POMC基因多態(tài)性及與南陽(yáng)牛生長(zhǎng)性狀的相關(guān)分析［J］.遺傳，2009，31(12):1 221～1 225.

［7］Nei M，Jajima F，Tateno Y.Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular date［J］.Journal of Molecular Evolution，1983，19(3):153～170.

［8］Valizadeh M，Kang K，Kanno A et al.Analysis of genetic distance among nine Medicago species by using DNA polymorphisms［J］.Breeding Science，1996，(46):7～10.

［9］馬淑慧，李亞楠，郝曉燕，等.POMC在不同毛色綿羊皮膚中的表達(dá)與定位［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48(9):1 818～1 824.

The Polymorphism of POMC Gene in Guanling Cattle

Zhang Chunxin1，Xu Longxin2，Liu Jing2*，He Guangzhong2
(1.Bureau of Animal Husbandry of Jinsha，Jinsha Guizhou 551800，China;2.Institute of Animal Husbandry and Veterinarina of Guizhou Province，Guiyang Guizhou 550005，China)

Pro－opiomelanocortin(POMC)plays an important role on animal ingestive behavior and energy homeostasis.Genetic variation of POMC was detected by DNA sequencing techniques in 92 individuals from Guanling cattle.The results showed that，5 mutation sites(138C ＞ T，430C ＞ T，644C ＞T，668C ＞T，693A＞G)were found in 870 bp amplified fragments.X2test showed that 5 mutation sites were all in HWE(P ＞0.05)but 430C ＞T，Analysis of genetic diversity indicated 5 mutation sites were at intermediate polymorphic status.

Guizhou Guangling Cattle;POMC Gene;Polymorphism

S821.2:Q7

A

1007－1474(2016)01－0001－03

2015－10－19

貴州省科學(xué)技術(shù)基金［黔科合J字LNK(2013)06號(hào)］;貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目，合同編號(hào):黔科合NY字［2011］3068;貴州省現(xiàn)代肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目［GZCYTX－03］

張純新(1968—)，男，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事畜牧生產(chǎn)技術(shù)推廣工作。

*通訊作者:劉鏡(1980—)，男，副研究員，主要從事畜牧生產(chǎn)技術(shù)的研究及推廣工作。