陳曉慶鄭少燕陳慶奇*（.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院　廣州　50405；.南方醫(yī)科大學附屬佛山市婦幼保健院佛山　58000）

HPLC法同時測定紫珠葉中3種有效成分含量△

陳曉慶1鄭少燕2陳慶奇2*（1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院廣州510405；2.南方醫(yī)科大學附屬佛山市婦幼保健院佛山528000）

摘要：目的：建立同時測定紫珠葉中3種有效成分的高效液相色譜（HPLC）方法。方法：采用ZORBAX Extend-C18色譜柱（4.6mm× 250mm，5μm），流動相為乙腈-0.1%乙酸水（10∶90），梯度洗脫，流速為1mL·min-1，檢測波長330nm，柱溫30℃。結果：毛蕊花糖苷、木犀草素及芝麻素分別在46.325～926.5μg·mL-1（r=0.9998）、0.81～16.2μg·mL-1（r=0.9997）及0.6625～13.25μg·mL-1（r=0.9999）范圍內線性關系良好，加樣回收率98.8%～101.4%。結論：建立的HPLC法簡便快速、重復性好、結果準確可靠，可作為紫珠葉藥材質量標準控制的方法。

關鍵詞：紫珠葉 HPLC有效成分 含量

紫珠葉為馬鞭草科植物杜虹花Callicarpa formosana Rolfe的干燥葉，具有涼血收斂止血、散瘀解毒消腫之功效；用于衄血、咯血、吐血、便血、崩漏、外傷出血等癥狀［1］。研究表明紫珠葉含有毛蕊花糖苷、木犀草素、芝麻素［2］等成分，其中毛蕊花糖苷為苯丙素苷類化合物，具有增強中樞膽堿能功能和保護神經元細胞作用［3］；芝麻素具有良好的抗氧化能力［4］。木犀草素屬于黃酮類化合物［5］，具有抗炎［6］、止血［7］作用，應是紫珠葉發(fā)揮散瘀止血之效的主要成分。但2015版《中國藥典》僅對紫珠葉中毛蕊花糖苷含量做出規(guī)定，未對其他有效成分含量做出規(guī)定。因此本實驗采用高效液相色譜法（HPLC）同時對紫珠葉中的3種有效成分進行測定，以完善紫珠葉質量標準。

1儀器與試藥

Waters 2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司），KQ-300DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），F(xiàn)A2004電子天平（上海恒平科學儀器有限公司），CX-500A型高速多功能粉碎機（上海市晟喜制藥機械有限公司）。

6批次紫珠葉購自廣東清平藥材市場，經鑒定為馬鞭草科植物杜虹花Callicarpa formosana Rolfe的干燥葉。

毛蕊花糖苷（批號：111530-201411，中國食品藥品檢定研究院）、木犀草素（批號：111520-201304，中國食品藥品檢定研究院）及芝麻素（購自美國Sigma公司）。乙腈、乙酸（色譜純，Sigma公司），蒸餾水（自制），其余試劑均為分析純。

2方法

2.1供試品溶液制備：將紫珠葉干燥、粉碎，過60目篩，精密稱定2.0g，置于錐形瓶中，加入80%甲醇60mL，40℃下超聲提取30min，冷卻，補足失重。搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，即得紫珠葉供試品溶液。

2.2混合對照品溶液的制備：分別精密稱取毛蕊花糖苷、芝麻素及木犀草素適量，置于同一100mL容量瓶中，加入80%甲醇定容至刻度，即得濃度為1.853、0.0324及0.0265mg/mL混合對照品溶液。

2.3色譜條件：ZORBAX Extend-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%乙酸水（10∶90），梯度洗脫：0～5min，10%A；5～25min，10%～60%A；25～30min保持60%A；30～70min，60%～80%A；檢測波長：330nm；流速：1.0mL·min-1；柱溫：30℃；進樣量：10μL。在該色譜條件下，5個待測成分色譜峰分離度均大于1.5，實驗結果見圖1A。

2.4線性關系考察：分別精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0及5.0mL至10mL容量瓶中，用80%甲醇定容至刻度，即得5個濃度的混合對照品溶液。按“2.3”項下選定的色譜條件進行測定，以對照品濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，經計算得回歸方程，結果見表1。

2.5精密度實驗：將“2.2”項下混合對照品溶液連續(xù)進樣6次，按“2.3”項下的色譜條件進行含量測定，記錄峰面積，并進行計算，結果毛蕊花糖苷、木犀草素及芝麻素的RSD分別為0.88%、0.47%及0.76%。

2.6穩(wěn)定性實驗：將同一供試品液按“2.2”項下的色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10h時各進樣一次，記錄其峰面積，計算各時間段毛蕊花糖苷、木犀草素及芝麻素峰面積的RSD為1.23%、0.98% 及1.54%，表明樣品溶液在10h內穩(wěn)定。

2.7重復性實驗：精密稱取同一批紫珠葉樣品粉末各6份，按“2.1”項下供試品溶液制備方法制備供試品，按“2.3”項下的色譜條件進行含量測定，記錄毛蕊花糖苷、木犀草素及芝麻素的峰面積，并進行計算，結果見表2，3種成分的RSD均小于2.0%，表明該實驗的重復性良好。

表2紫珠葉中3種成分重復性實驗結果Tab.2 Experimental results of 3 kinds of components

2.8加樣回收率實驗：精密稱取1.0g已知含量的紫珠葉粉末6份，分別精密加入混合對照品溶液，按“2.1”項下供試品溶液制備法處理，依次測定，計算加樣回收率及平均加樣回收率。結果見表3至表5，毛蕊花糖苷平均加樣回收率為101.4%，RSD為1.54%；木犀草素平均加樣回收率為99.5%，RSD為0.83%；芝麻素平均加樣回收率為98.8%，RSD為0.78%，表明該測量方法所得結果可行、可靠，能夠滿足測量需要。

表3毛蕊花糖苷加樣回收實驗結果Tab.3 Experimental results of Verbascoside

表4木犀草素加樣回收實驗結果Tab.4 Experimental results of Luteolin

表5芝麻素加樣回收實驗結果Tab.5 Experimental results of Sesamin

2.9樣品的測定：取6個批次紫珠葉樣品分別按照“2.1”項下每批次制備3份供試品溶液，按照“2.3”項下方法檢測3種成分的含量，檢測圖譜見圖1B，含量計算結果見表6。

表6樣品的含量測定結果（n=3）Tab.6 The content determination results of samples（n=3）

3結論與討論

3.1供試品溶液制備方法的確定：本實驗分別考察了不同提取溶劑（甲醇、80%甲醇、乙醇及80%乙醇）、不同提取方法（超聲及回流）以及不同提取時間（20、30、40及50min）對6種成分提取率的影響，結果發(fā)現(xiàn)采用60mL80%甲醇超聲處理30min效果最佳，該條件下紫珠葉中6個有效成分提取率相對最高。

3.2檢測波長的選擇：對供試品在400～190nm波長范圍內進行全波長光譜掃描，記錄三維光譜圖，經對各個波長的供試品色譜圖進行比較，發(fā)現(xiàn)以330nm為檢測波長，3個峰基線較平穩(wěn)、分離效果好、響應值均較大，能較好反映樣品中3個成分的信息。

3.3柱溫的選擇：本實驗考察了不同柱溫（25、30、35及45℃）對3個成分分離效果的影響，結果發(fā)現(xiàn)柱溫控制在30℃時，3個成分與相鄰色譜峰分離效果較好。

3.4測定結果分析：本實驗考察了不同批次廣西所產紫珠葉中3個有效成分的含量，由結果可知，紫珠葉中毛蕊花糖苷總量符合《中國藥典》要求（不少于0.5%）［1］。3個有效成分的含量差異較大，其中毛蕊花糖苷的質量分數(shù)遠高于其他兩個成分。

本實驗建立的HPLC方法操作簡單、準確、重復性好，具有分離效果好、方法重復性好等諸多優(yōu)點，為紫珠葉質量標準的完善提供理論基礎。

參考文獻

［1］中華人民共和國藥典委員會.中國藥典（第一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：320.

［2］任風芝，賀秉坤，欒新慧，等.紫珠葉的化學成分研究Ⅲ［J］.中國藥學雜志，2004，39（1）：17-19.

［3］高莉，彭曉明，霍仕霞，等.毛蕊花糖苷改善D-半乳糖致亞急性衰老小鼠腦損傷的作用［J］.中草藥，2014，45（1）：81-85.

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［5］余行，徐詩強，馬冬晴，等.大葉紫珠總黃酮的提取工藝優(yōu)選及其抗炎、鎮(zhèn)痛及止血作用考察［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（12）：8-11.

［6］余行，徐詩強，馬冬晴，等.大葉紫珠總黃酮的提取工藝優(yōu)選及其抗炎、鎮(zhèn)痛及止血作用考察［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（12）：8-11.

［7］Seelinger G，Merfort I，Schempp C M.Anti-oxidant，anti-inflammatory and anti-allergic activities of luteolin［J］.Planta medica，2008，74（14）：1667.

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A

文章編號：1672-8351（2016）07-0001-03

基金項目：△廣東省科技廳產學研結合項目（2010B090400529）。

*通訊作者

Simultaneous determination of 4 active components in Callicarpae Formosanae Folium by HPLC method

Chen Xiaoqing1Zheng Shaoyan2Chen Qingqi2*（1.The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong Guangzhou 510405，PR China；2.Department of Pharmacy，F(xiàn)oshan Affiliated Maternal and Children’s Hospital of Southern Medical University，Guangdong Foshan 528000，PR China）

Abstract：Objective：Establish HPLC method for simultaneous determination of 4 active components in Callicarpae Formosanae Folium. Methods：Using a ZORBAX Extend-C18column（4.6mm×250mm，5μm），the mobile phase was acetonitrile and 0.1%acetic acid（acetic acid：water，10∶20），gradient elution，flow rate was 1mL·min-1，the detection wavelength was 330nm and the column temperature was 30℃.Results：Verbascoside，luteolin and sesamin in46.325～926.5μg·mL-1（r=0.9998）、0.81～16.2μg·mL-1（r=0.9997）and 0.6625～13.25μg·mL-1（r=0.9999）were with a good linear，recovery rate range from 98.5%to 100.9%.Conclusion：The established HPLC method is simple，rapid，reproducible，accurate and reliable，and can be used to control the quality standard of Callicarpae Formosanae Folium.

Key words：Callicarpae Formosanae Folium HPLC Effective components Content