劉有晴，倪月，黃丹，鄢平，程華，于華，毛祥（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

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四川曬制麩醋中醋酸菌分離鑒定及產(chǎn)酸特性

劉有晴，倪月，黃丹*，鄢平，程華，于華，毛祥
（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

摘要：對四川曬制麩醋醋醅中的醋酸菌采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)的分離方法進行分離鑒定，并對該菌在不同pH、發(fā)酵溫度、供氧量條件下的產(chǎn)酸能力進行研究。結(jié)果表明：分離獲得了一株產(chǎn)酸能力較強的菌株，經(jīng)16SrDNA鑒定為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）。通過對其產(chǎn)酸特性進行研究，該菌株的最適產(chǎn)酸條件為：最適初始pH 5.0，最適溫度為35℃，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，總酸含量可達2.8884g/100mL。

關(guān)鍵詞：醋醅；醋酸菌；分離鑒定；產(chǎn)酸特性

四川曬制麩醋是以麥麩為釀制食醋的主要原料，以藥曲為糖化發(fā)酵劑，采用糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵同池進行發(fā)酵生產(chǎn)［1］，其醋醅需經(jīng)過3年左右的曬制，期間日曬夜露，微生物類群交替作用，形成了其獨特風(fēng)味。

醋酸菌是專性好氧細菌，其氧化乙醇為乙酸的作用是由于它的細胞膜上含有高活性的乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶復(fù)合體。不同醋酸菌其發(fā)酵產(chǎn)物不同，醋酸菌除了主要生成醋酸外，還能生成羥基酸，如羥基乙酸、草酸、酒石酸、己二酸、琥珀酸、甘露糖酸和葡萄糖酸等。醋酸中殘留的乙醇又與這些酸類發(fā)生酯化反應(yīng)生成不同的酯類，構(gòu)成食醋中的香氣成分［2］。因此醋酸菌在食醋釀造過程中有非常重要的作用。

目前，關(guān)于食醋中醋酸菌的研究非常活躍，但都是針對四大名醋中鎮(zhèn)江香醋、山西老陳醋［3-4］中醋酸菌分離鑒定及初步應(yīng)用等方面，關(guān)于四川曬制麩醋中醋酸菌的研究還鮮見報道。本文主要針對四川曬制麩醋中的醋酸菌進行篩選、分離純化及鑒定，并對獲得的醋酸菌產(chǎn)酸特性進行研究，對改善四川曬制麩醋長期以來存在的出醋率低、生產(chǎn)周期長的現(xiàn)狀，具有積極意義。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1試驗材料

麩醋醋廠醋醅。

1.1.2主要培養(yǎng)基

分離純化培養(yǎng)基：葡萄糖1g，酵母膏1g，碳酸鈣2g，瓊脂2 g，水100 mL，121℃滅菌20 min，冷卻至70℃加入3.5 mL無水乙醇［5］；斜面試管保藏培養(yǎng)基：除不加碳酸鈣外，其他同分離純化培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏1 g，葡萄糖1 g，硫酸鎂0.05 g，磷酸二氫鉀0.05 g，水100 mL，滅菌后加入7%（體積分?jǐn)?shù)）無水乙醇。

1.1.3主要儀器設(shè)備

超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備廠；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海蘇坤實業(yè)有限公司；高速冷凍離心機：德國Hettich公司；PCR儀：美國BIA-RAD公司；凝膠成像系統(tǒng)：上海山富科學(xué)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1菌株分離

稱取5.0 g醋醅于裝有45 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，使之稀釋濃度為10-1。再從該三角瓶中取1 mL于裝有9 mL無菌生理鹽水的試管中，依次稀釋，使醋醅的濃度梯度為10-4、10-5、10-6。分別取10-4、10-5、10-6的稀釋液0.2 mL涂抹平板分離培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48 h后觀察。根據(jù)醋酸菌的形態(tài)特征及碳酸鈣溶菌圈的大小挑取醋酸菌單菌落。把分離得到的單菌落在平板上多次劃線分離、培養(yǎng)，通過革蘭氏染色鏡檢確認(rèn)是形態(tài)單一的單菌落后，移種于試管斜面，培養(yǎng)，備用。

1.2.2菌株形態(tài)學(xué)鑒定

1.2.2.1形態(tài)學(xué)觀察

對已分離出的菌株進行革蘭氏染色。

1.2.2.2醋酸鈣鑒定試驗

醋酸鈣鑒定培養(yǎng)基：酵母膏1 g，醋酸鈣1 g，瓊脂2.5 g，水100 mL，pH 7.2左右。觀察平板是否出現(xiàn)透明圈。

1.2.2.3醋酸定性試驗

醋酸定性液體培養(yǎng)基：酵母膏1 g，水100 mL，滅菌后加入無水乙醇7mL，pH4.5。鑒定方法：35℃150 r/min搖瓶5d，取培養(yǎng)液加NaOH中和，再加10%FeCl3，2滴～3滴，搖勻，在火焰上加熱，觀察是否有紅褐色沉淀生成［6］。

1.2.3菌株16SrDNA鑒定［7］

分子生物學(xué)鑒定流程：基因組DNA的提?。⊿DS裂解法）→電泳→PCR擴增→電泳→測序（上海杰李生物測序公司）→NCBI/Blast Nucleotide比對→構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4醋酸菌產(chǎn)酸特性研究

1.2.4.1初始pH對分離菌株產(chǎn)酸能力的影響

取7個250 mL三角瓶編號，加入25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，接種2%（體積分?jǐn)?shù)）醋酸菌菌懸液。分別于pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0下在上述最佳溫度及搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)48 h，測定總酸（以醋酸計），確定最適發(fā)酵初始pH［8］。

1.2.4.2溫度對分離菌株產(chǎn)酸能力的影響

取5個250 mL三角瓶編號，加入25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，接種2%（體積分?jǐn)?shù)）醋酸菌菌懸液，分別于25、30、35、40、45℃溫度下，自然pH下150 r/min搖床培養(yǎng)48 h，測定總酸，確定最適發(fā)酵溫度。

1.2.4.3供氧量對分離菌株產(chǎn)酸能力的影響

取5個250 mL三角瓶編號，加入25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，接種2%（體積分?jǐn)?shù)）醋酸菌菌懸液。分別于100、125、150、175、200 r/min，在自然pH、最佳培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)48 h，測定總酸，確定最適發(fā)酵供氧量。

2　結(jié)果與分析

2.1醋酸菌形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1菌株菌落形態(tài)及細胞形態(tài)觀察

通過分離純化培養(yǎng)基測定其透明圈的大小，篩選出一株產(chǎn)酸能力強的醋酸菌，命名為J8。在分離純化平板中菌株的菌落形態(tài)為：菌落呈圓形、中間隆起、邊緣波狀、表面平滑。通過革蘭氏染色看到分離菌株為革蘭氏陰性菌，短桿狀。

2.1.2醋酸鈣鑒定試驗

從醋酸鈣鑒定試驗中可知：該菌株菌落周圍形成的不透明的白色暈圈，該白色暈圈成分為碳酸鈣，醋酸菌可以將醋酸根繼續(xù)氧化成碳酸根，碳酸根與鈣離子結(jié)合成碳酸鈣，從而形成白色暈圈，說明該菌株能利用酒精形成醋酸。

2.1.3醋酸定性試驗

醋酸能夠與鐵離子在高溫條件下發(fā)生配位反應(yīng)而形成紅褐色沉淀。對所分離出的菌株進行醋酸定性試驗，試管中有紅褐色沉淀生成，表明該菌株具有產(chǎn)醋酸的能力。

2.216SrDNA同源性序列分析及系統(tǒng)發(fā)育育樹的構(gòu)建

2.2.1DNA提取及PCR擴增結(jié)果

采用SDS裂解法將醋酸菌J8的純菌DNA提取出，其電泳圖如圖1所示。經(jīng)過PCR擴增后電泳結(jié)果如圖2所示。

從圖中可以看出PCR擴增后其DNA條帶非常明顯，而且沒有存在拖帶的現(xiàn)象。

2.2.2系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

通過對已提取出的DNA進行測序，該菌株經(jīng)鑒定為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）。通過NCBI進行同源序列比對，然后利用MEGA6.0軟件對該菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。

圖1　純菌DNA電泳圖Fig.1　Electrophoresis of pure bacteria DNA

圖2　PCR擴增電泳圖Fig.2　Electrophoresis of PCR amplification

圖3　系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3　Phylogenetic tree

由圖3可知，該菌株與巴氏醋桿菌BCRC 12325同源性最近，因此可以認(rèn)為此菌株為巴氏醋桿菌。

2.3產(chǎn)酸特性研究

2.3.1發(fā)酵初始pH對分離菌株產(chǎn)酸的影響

pH對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響如圖4所示。

圖4　pH對醋酸菌產(chǎn)酸的影響Fig.4　Effect of pH value on the ability of producing acid by acetic acid bacteria

由圖4可知，在pH為5.0左右該醋酸菌菌株產(chǎn)酸能力最強，總酸為2.378 0 g/100 mL。在酸性條件下醋酸菌產(chǎn)酸能力較強，而在中性或弱堿性條件下醋酸菌產(chǎn)酸能力急劇下降至0.822 7 g/100 mL。在麩醋釀制過程中，醋醅曬制過程中環(huán)境pH為酸性，而該菌株在酸性條件下能很好的生長及產(chǎn)酸，說明該菌株適合曬制麩醋的發(fā)酵生產(chǎn)。

2.3.2發(fā)酵溫度對分離菌株產(chǎn)酸的影響

溫度對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響如圖5所示。

圖5　溫度對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響Fig.5　Effect of temperature on the ability of producing acid by acetic acid bacteria

由圖5可知，溫度對醋酸菌產(chǎn)酸能力有明顯的影響，發(fā)酵溫度控制在35℃左右該株醋酸菌產(chǎn)酸能力最強，總酸為2.702 3 g/100 mL。而當(dāng)溫度高于35℃時，該菌株產(chǎn)酸能力急劇下降至1.285 1 g/100 mL，由于溫度太高導(dǎo)致該菌株生長緩慢，因此產(chǎn)酸能力呈現(xiàn)下降趨勢。

2.3.3供氧量對醋酸菌產(chǎn)酸的影響

供氧量對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響如圖6所示。

圖6　供氧量對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響Fig.6　Effect of oxygen supply on the ability of producing acid by acetic acid bacteria

由圖6可知，搖床轉(zhuǎn)速控制在150 r/min左右該株醋酸菌產(chǎn)酸能力最強，其值為2.888 4 g/100 mL。轉(zhuǎn)速偏低的情況下，供氧量不足，導(dǎo)致產(chǎn)酸能力受影響；轉(zhuǎn)速過高時，雖然供氧量充足，但由于作為醋酸發(fā)酵底物的乙醇具有很強的揮發(fā)性［9］，轉(zhuǎn)速偏高影響了乙醇的損耗速度，因此，轉(zhuǎn)速在高于150 r/min時產(chǎn)酸量逐漸降低。

3　討論

本試驗通過從四川曬制麩醋醋醅中分離純化出一株產(chǎn)酸能力強的醋酸菌，并經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）。該菌株的最適產(chǎn)酸條件為：初始pH 5.0，最適溫度為35℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，總酸含量可達2.888 4 g/100 mL。目前對四川曬制麩醋中功能菌的研究還很少，大量的研究，本文對醋酸菌的分離鑒定及最適產(chǎn)酸條件的研究，可為后續(xù)該菌株在曬制麩醋釀造過程中的應(yīng)用研究提供數(shù)據(jù)支撐，同時也為四川曬制麩醋釀造工藝上采用純菌發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.039

基金項目：四川省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃（201410622006）；固態(tài)釀造關(guān)鍵技術(shù)研究四川省院士（專家）工作站基金項目（GY2015-02）；四川理工學(xué)院學(xué)科建設(shè)工程資助項目（2013TS13）；四川理工學(xué)院研究生創(chuàng)新基金（y2014026）；四川省經(jīng)濟和信息化委員會企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新專項（2015LZ00264）

作者簡介：劉有晴（1990—），女（漢），在讀碩士，主要從事固態(tài)釀造功能微生物方面的研究。

*通信作者：黃丹（1968—），女，教授，本科，主要從事固態(tài)釀造微生物及應(yīng)用方面的研究。

收稿日期：2015-05-26

Screen and Identification and Acid Characteristics of Acetic Acid Bacteria in Sichuan Bran Vinegar

LIU You-qing，NI Yue，HUANG Dan*，YAN Ping，CHENG Hua，YU Hua，MAO Xiang

（School of Biotechnoligy Engineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

Abstract：Acetic acid bacteria in solid fermentation substrate of Sichuan bran-vinegar were isolated and identified by using traditional cultured separation method，and the acid producing ability under the condition of pH，different fermentation temperature，oxygen supply were studied.The results showed that：a strain had strong acid producing ability was isolated，it was named Acetobacter pasteurianus through the method of molecular biology.Through the research on its metabolic conditions，the optimal fermentation conditions of this strain：optimal initial pH 5.0，the optimal temperature 35℃，shaker speed 150 r/min，the acid content up to 2.888 4 g/100 mL. Key words：vinegar；acetic acid bacteria；isolate and identify；characteristics of acid production