李 晶，鄭新元，王 杰

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

HPLC法測(cè)定枸杞子配方顆粒中甜菜堿的含量

李 晶，鄭新元，王 杰*

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

目的:建立枸杞子配方顆粒中甜菜堿的含量測(cè)定方法。方法:采用高效液相色譜法，乙腈－水(85∶15)為流動(dòng)相，流速為1．0 ml/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為200 nm，色譜柱為Kromasil NH2(250 mm×4．6 mm，5 μm)。結(jié)果:6個(gè)廠家13批次的枸杞子配方顆粒中甜菜堿含量介于0．542 8～2．055 6 mg/g之間。結(jié)論:該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于枸杞子配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

枸杞子配方顆粒，HPLC，甜菜堿

枸杞子是我國(guó)常用中藥之一，為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L的干燥成熟果實(shí)，味甘，性平，具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目的功效［1］，用于治療虛勞精虧、腰膝酸痛、眩暈耳鳴、陽(yáng)痿遺精、內(nèi)熱消渴、血虛萎黃、目昏不明。枸杞子配方顆粒是將單味枸杞子飲片經(jīng)現(xiàn)代提取技術(shù)及制劑工藝精制而成的，是供中醫(yī)臨床代替飲片用的配方顆粒。甜菜堿是枸杞子中主要成分之一，且含量較高，對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，可以保證臨床用藥的安全、有效。《中國(guó)藥典》2015年版枸杞子項(xiàng)下關(guān)于甜菜堿的定量方法仍采用薄層掃描法，該方法操作復(fù)雜，重復(fù)性差，不利于有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。本文建立的HPLC法測(cè)定枸杞子配方顆粒中甜菜堿的含量，操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，適合作為該品種的含量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

LC－10A型高效液相色譜儀;SPD－10A紫外檢測(cè)器;Anastar色譜工作站。甜菜堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110894－200503)。枸杞子配方顆粒由廣東一方制藥有限公司(廠家 1，批號(hào)1110021、1109254)、江陰天江藥業(yè)有限公司(廠家2，批號(hào)1110127、1108461)、四川新綠色藥業(yè)股份有限公司(廠家3，批號(hào)1109058、1110138)、北京康仁堂藥業(yè)有限公司(廠家4，批號(hào)101001、101101)、華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司(廠家5，批號(hào)1106181S、1109011S)、培力(南寧)藥業(yè)有限公司(廠家6，批號(hào)A110362、A110678)提供。1，2－二氯甲烷為色譜純，乙腈為色譜純，水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 由于甜菜堿結(jié)構(gòu)中沒有明顯的共軛雙鍵，屬于末端吸收，故選200 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，提高檢測(cè)靈敏度。

2.2 色譜條件 色譜柱:迪馬公司Kromasil NH2(250 mm×4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈－水(85∶15);流速:1．0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):200 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20 μl。理論板數(shù)按甜菜堿計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.3 溶液的制備

2．3．1 對(duì)照品溶液的制備 取甜菜堿對(duì)照品10．64 mg，精密稱定，置25 ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液。再精密吸取3．0 ml至10 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2．3．2 供試品溶液的制備 取重量差異下的枸杞子配方顆粒，研細(xì)，取適量(相當(dāng)于1．0 g飲片)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入1，2－二氯甲烷－甲醇的混合液(50∶50)50 ml，超聲處理30 min，放冷，濾過，并用少量混合液洗滌容器及藥渣，洗液并入濾液中，濾液通過堿性氧化鋁柱(內(nèi)徑1．5 cm，8 g，干法裝柱)，用100 ml混合液洗脫，收集洗出液及洗脫液，蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解并轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μl，按“2．2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，見圖1。

圖1 甜菜堿對(duì)照品(A)枸杞子配方顆粒(B)的HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系試驗(yàn) 取0．425 6 mg/ml甜菜堿對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密吸取0、1．0、2．0、3．0、4．0和5．0 ml分別置10 ml量瓶中，以流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。分別取上述溶液20 μl注入液相色譜儀，按上述色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積值。以濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1 158．91 X－531．0(r=0．999 9)。結(jié)果表明甜菜堿在0～212．80 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取線性關(guān)系試驗(yàn)項(xiàng)下濃度為127．68 μg/ml的對(duì)照品溶液，按“2．2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積值，其RSD值為0．97%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2．6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取枸杞子配方顆粒(廣東一方制藥有限公司，批號(hào)1109254)供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8和24 h測(cè)定峰面積值，其RSD值為0．5%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)測(cè)定是穩(wěn)定的。

2．7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取上述同一批號(hào)枸杞子配方顆粒6份，按“2．3．2”項(xiàng)下制備方法制成供試品溶液。按“2．2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定樣品峰面積值并計(jì)算樣品中甜菜堿的含量，結(jié)果測(cè)得枸杞子配方顆粒中甜菜堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．403 0%，RSD為1．09%。

2．8 回收率試驗(yàn) 取上述同一批號(hào)枸杞子配方顆粒，精密稱取150 mg，平行6份，分別精密加入甜菜堿對(duì)照品溶液(濃度為0．122 2 mg/ml)5 ml，補(bǔ)加1，2－二氯甲烷－甲醇的混合液(50∶50)至50 ml，再按上述“2．3．2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法操作，按“2．2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積值，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為99．87%，RSD為1．77%，見表1。

2．9 樣品測(cè)定 取枸杞子配方顆粒各廠家各批次樣品，按上述“2．3．2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成供試品溶液。按上述色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積值，計(jì)算每相當(dāng)于1 g飲片的枸杞子配方顆粒含甜菜堿的量(mg/g)，結(jié)果見表2。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2 樣品的測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 測(cè)定方法的選擇 有文獻(xiàn)報(bào)道［2］，采用HPLC法測(cè)定枸杞子中甜菜堿的含量，但供試品采用離子交換樹脂進(jìn)行前處理，操作復(fù)雜，誤差較大，重現(xiàn)性不好。本實(shí)驗(yàn)建立的方法重復(fù)性好，易于操作。

3.2 樣品前處理方法的選擇 參照文獻(xiàn)［3］報(bào)道方法，試驗(yàn)中分別考查了甲醇提取、甲醇提取后經(jīng)陽(yáng)離子交換樹脂凈化方法，結(jié)果顯示雜質(zhì)干擾較大，本實(shí)驗(yàn)采用了1，2－二氯乙烷－甲醇的混合液(50∶50)提取，堿性氧化鋁凈化的方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理。

3.3 提取時(shí)間的選擇 在提取供試品過程中，分別超聲處理10、20、30和40 min，試驗(yàn)結(jié)果表明:超聲30 min提取的甜菜堿的量與40 min時(shí)相比，其含量基本一致，故提取時(shí)間選擇30 min。

3.4 洗脫溶媒的選擇 選用不同比例的洗脫液:分別為1，2－二氯乙烷 －甲醇(95∶5)、(90∶10)、(85∶15)、(80∶20)、(70∶30)、(60∶40)、 (50∶50)、(40∶60)、(30∶70)、(20∶80)和(10∶90)，試驗(yàn)結(jié)果表明:甜菜堿在1，2－二氯乙烷－甲醇(80∶20)時(shí)，開始洗脫下來，在1，2－二氯乙烷－甲醇(30∶70)時(shí)，開始出現(xiàn)雜質(zhì)峰，干擾測(cè)定，1，2－二氯乙烷－甲醇(70∶30)到(50∶50)時(shí)洗脫的最多，故洗脫溶媒選擇1，2－二氯乙烷－甲醇(50∶50)。

1 中國(guó)藥典［S］．一部．2015:249

2 甄錄旭，方宗華，吳海林，等．HPLC法測(cè)定枸杞子中甜菜堿的含量［J］．安徽醫(yī)藥，2007，11(8):703－704

3 方麗，祝明，鄭成．HPLC法測(cè)定枸杞子中甜菜堿的含量［J］．中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2011，12(4):288－291

Determination of content of betaine in Wolfberry fruit formula granule by HPLC

Li Jing，Zheng Xinyuan，Wang Jie
(Tianjin Insititute for Drug Control，Tianjin 300070)

Objective:To establish an HPLC method for determination of betaine in wolfberry fruit formula granule．Methods: HPLC was performed on a Kromasil NH2(250 mm×4．6 mm，5 μm)column at 30℃ with mobile phase consisting of acetonitrilewater(85∶15)，the flow rate was 1．0 ml/min，the detection wavelength was 200 nm．Results:The content of betaine in wolfberry fruit formula granule in 13 batches from six factories ranged between 0．542 8～2．055 6 mg/g．Conclusion:The method is simple and reliable，and can be used for the quality evaluation of betaine in wolfberry fruit formula granule．

wolfberry fruit formula granule，HPLC，betaine

R927．2

A

1006-5687(2016)03-0004-03

2016-03-03

天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(No．12ZCZDSY01000)

*通訊作者:王杰，E－mail:tjyjsjie@sina．cn。