錢雪婷++陳文強(qiáng)++彭浩++解修超++鄧百萬

摘要：對(duì)秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳供試菌株進(jìn)行酯酶同工酶垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，結(jié)果表明，41個(gè)供試菌株共檢測(cè)到19條不同遷移率酯酶同工酶酶帶，各菌株有5～9條不等的酶帶，共16個(gè)酶譜類型。應(yīng)用NTSYS-pc 2.11軟件分析，41個(gè)黑木耳菌株兩兩之間的相似系數(shù)分布在0.474～1.000之間，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為80%時(shí)，41個(gè)黑木耳供試菌株被聚類分成5類，初步鑒定了41個(gè)供試菌株間的親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞：秦巴山區(qū)；黑木耳；酯酶同工酶；親緣關(guān)系

中圖分類號(hào)： S646.603文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0269-03

收稿日期：2015-09-23

基金項(xiàng)目：陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：2014K01-16-03）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃（編號(hào)：2012HBGC-20）。

作者簡(jiǎn)介：錢雪婷（1990—），女，陜西略陽人，碩士研究生，主要從事微生物資源利用開發(fā)等研究。E-mail：qianxueting163@163.com.

通信作者：陳文強(qiáng)，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事微生物資源開發(fā)保護(hù)及利用相關(guān)研究。E-mail：wenqiangc@126.com.黑木耳（Auricularia auricular），別稱木耳、細(xì)耳、云耳、黑葉、木蛾，分類上屬異擔(dān)子菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬，子實(shí)體一般較小，膠質(zhì)，淺圓盤形、耳形或不規(guī)則形[1]，是一種含有極高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的美味食用菌[2]?，F(xiàn)代研究表明，黑木耳具有抗氧化、抗菌、抗癌，增強(qiáng)體液免疫等多種功效[3-5]。秦巴山區(qū)氣候溫和濕潤(rùn)，適宜菌類生長(zhǎng)，是我國(guó)黑木耳的主要栽培基地之一。近年來，由于部分地區(qū)對(duì)黑木耳菌株的管理存在很多缺陷，黑木耳菌株亂引種、亂命名的現(xiàn)象較為嚴(yán)重，使同一菌株冠以不同的品種代號(hào)或不同菌株冠以相同的品種代號(hào)，造成黑木耳菌種、品種的混亂。目前，黑木耳種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究逐漸受到重視，Tang等[6]、李媛媛等[7]、張旭等[8]、唐利華等[9]分別利用ISSR和SRAP分子標(biāo)記、SCAR分子標(biāo)記、SRAP和ITS分子標(biāo)記、酯酶同工酶分析對(duì)我國(guó)不同地區(qū)黑木耳栽培菌株以及野生菌株的親緣關(guān)系，結(jié)果表明，我國(guó)黑木耳菌株具有較高的遺傳多樣性。本研究利用酯酶同工酶技術(shù)對(duì)秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳菌株的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，旨在為黑木耳菌種管理和種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳供試菌株及來源見表1。

1.1.2培養(yǎng)基母種培養(yǎng)基（CPDA）：20%馬鈴薯，2%葡萄糖，0.5% KH2PO4，0.3% MgSO4·7H2O，0.001% 維生素B1，1.2%瓊脂，pH值自然。同工酶制備液體培養(yǎng)基（元蔥培養(yǎng)基）：20%元蔥，1%蔗糖，0.006%阿魏酸，pH值自然。

1.1.3主要儀器高壓蒸汽滅菌鍋（MJ-54A型，上海施都凱儀器設(shè)備有限公司）；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2F型，蘇州凈化設(shè)備有限公司）；電子分析天平（TB-214型，北京賽得利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；離心機(jī)（5418R型，德國(guó)Eppendorf）；電泳儀（DYCZ-24B型，北京市六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（GEL-RAD型，美國(guó)伯樂）。

1.2方法

1.2.1樣品制備將黑木耳菌株接種于CPDA斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿管后，4 ℃冰箱保藏備用；將活化后的黑木耳菌株，接種到元蔥培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶裝液量為100 mL，28 ℃靜置培養(yǎng)20 d。將菌絲體過濾，蒸餾水沖洗，濾紙吸干水分，稱質(zhì)量，放入研缽中，加入液氮充分研磨，分裝于離心管，8 000 r/min，4 ℃離心20 min，上清液為酶液。

1.2.2酯酶同工酶的檢測(cè)采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳法[10]，配制5%濃縮膠，10%分離膠，電極緩沖液為Tris-Glycine系統(tǒng)，pH值8.3。上樣量：酶液6 μL，溴酚藍(lán)指示劑2 μL，10%蔗糖5 μL。濃縮膠電壓80 V，室溫，電泳45 min，分離膠電壓120 V，4 ℃，電泳4 h。取下凝膠，置于α、β-乙酸萘酯和堅(jiān)牢藍(lán)配制的染色液中，37 ℃，輕微振蕩，染色 25 min，將出現(xiàn)紅褐色酶帶的凝膠置于7%醋酸溶液中脫色、保存，掃描照相。

1.2.3聚類分析相對(duì)遷移率Rf=X/Y，X為從點(diǎn)樣孔下沿開始，酶帶在凝膠中的遷移距離，Y為從點(diǎn)樣孔下沿開始，指示劑在凝膠中的遷移距離。在測(cè)量遷移距離時(shí)，以酶帶的中部位置為準(zhǔn)。依據(jù)酯酶酶譜，按照條帶的有無進(jìn)行標(biāo)記，在相同遷移率位置上，有條帶的記為1，無條帶的記為0。利用NTSYS-pc 2.11軟件，分析得到秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳菌株的聚類分析樹狀圖。

2結(jié)果與分析

2.1酯酶同工酶酶譜分析

秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳供試菌株酯酶同工酶酶譜見圖1。根據(jù)各菌株間酶帶顏色和寬窄的差異[9]，酯酶酶帶可分為：一級(jí)酶帶（色深而寬）；二級(jí)酶帶（色較深而寬）；三級(jí)酶帶（色較淺而窄）；四級(jí)酶帶（色很淺而窄），結(jié)合酯酶酶譜，繪制酯酶同工酶模式圖（圖2）。

圖1顯示，秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳供試菌株共檢測(cè)到281條酯酶同工酶酶帶，各菌株有5～9條不等的酶帶，且多數(shù)為6～8條。41個(gè)供試菌株的遷移率分析表明，共有19條遷移率不同的酶帶，遷移率都在0.344～0.606之間。41個(gè)供試菌株在Rf值為0.356和0.469這2處均有酶帶出現(xiàn)，可能為黑木耳的共有酯酶酶帶。41個(gè)菌株共得到16個(gè)酶譜類型，其中黑木耳36#、耳菊3#、耳266、耳913、耳2、耳269、神農(nóng)A8、RF201以及甘1各為1個(gè)酶譜類型；耳5#、分四、國(guó)興2#、野1#、耳1#、國(guó)興1#、耳冬梅1#、高產(chǎn)1#、耳3#、新耳5#、新科1#、木耳（袋）、耳256以及新科的酶譜帶型基本相同；耳91、新科4#、LY16#、商洛Li、耳801以及耳261的酶譜帶型基本相同；QD3#、QD4#、新科5#以及Au29的酶譜帶型基本相同；耳238與耳629的酶譜帶型基本相同；耳268與112冬的酶譜帶型基本相同；國(guó)興3#與分六的酶譜帶型基本相同；耳235與耳97-2的酶譜帶型基本相同。

圖2顯示，在相同Rf值處，不同黑木耳菌株的酶帶等級(jí)不同（酶帶顏色深淺與寬窄不同）。且41個(gè)黑木耳菌株在Rf值為0.441處，一級(jí)酶帶較多，表明黑木耳菌株該酯酶活性高且含量高；在Rf值為0.469與0.494這2處，二級(jí)酶帶較多，表明這些酯酶活性較高且含量較高；在Rf值為0.356、0.396以及0.586等處，三級(jí)酶帶與四級(jí)酶帶較多，表明這些酯酶活性低且含量低。

2.2聚類分析

根據(jù)酯酶酶譜，應(yīng)用NTSYS-pc 2.11軟件，構(gòu)建秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳供試菌株聚類分析樹狀圖（圖3）。

圖3顯示，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為70%時(shí)，秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳供試菌株被聚類分成3類。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為80%時(shí)，41個(gè)黑木耳供試菌株被聚類分成5類，第1類：耳266、國(guó)興3#以及分六；第2類：耳5#、分四、國(guó)興2#、野1#、耳1#、國(guó)興1#、耳冬梅1#、高產(chǎn)1#、耳3#、新耳5#、新科1#、木耳（袋）、256、新科、耳菊3#、耳268、112冬、耳91#、新科4#、LY16#、商洛Li、耳801、耳261、36號(hào)、耳238、耳629以及耳913；第3類：QD4#、QD3#、新科5#、Au29以及RF201；第4類：耳97-2、耳235、耳269以及神農(nóng)A8；第5類：耳2以及甘1。

3討論

同工酶分子標(biāo)記是從基因產(chǎn)物水平來研究生物的遺傳變異，是一種重要的分子遺傳標(biāo)記技術(shù)[11]，酶帶的變化可作為鑒定物種，研究分類、進(jìn)化、遺傳和變異的重要指標(biāo)[12]，也是對(duì)食藥用菌進(jìn)行遺傳分析或生化鑒定中的最適標(biāo)記手段之一。自Markert等提出同工酶概念以來，酯酶同工酶標(biāo)記技術(shù)在食用菌研究中逐步得到廣泛的應(yīng)用[13-15]。

本研究將秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳供試菌株在嚴(yán)格統(tǒng)一的條件下，如相同的培養(yǎng)溫度、時(shí)間，相同的酶液制備方法等，采用5%濃縮膠與10%分離膠進(jìn)行垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，共檢測(cè)到19條不同遷移率的酯酶酶帶，16個(gè)酶譜類型，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為80%時(shí)，聚類分成5類，如耳97-2、耳235、耳269以及神農(nóng)A8被聚類在一個(gè)分支上，表明這4個(gè)菌株親緣關(guān)系較近。彭浩等對(duì)陜南10種黑木耳主要栽培種進(jìn)行酯酶同工酶的分析，檢測(cè)到8條不同遷移率的酯酶酶帶，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為80%時(shí)，聚類分成5類[16]。與之相比，本研究選用的供試菌種地域和菌株數(shù)更為廣泛，且檢測(cè)出的酯酶酶帶較豐富，聚類結(jié)果更加精細(xì)。

通過酯酶同工酶分析，得到秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳供試菌株聚類分析樹狀圖，初步鑒定了不同菌株之間的親緣關(guān)系。結(jié)果表明，秦巴山區(qū)黑木耳菌株的酯酶多態(tài)性高，種質(zhì)資源較為豐富，為秦巴山區(qū)黑木耳優(yōu)良菌種的選育以及菌種的管理工作提供理論依據(jù)。由于酯酶活性很容易受到外界因素的影響，酯酶同工酶的穩(wěn)定性以及試驗(yàn)的可重復(fù)性不高，對(duì)秦巴山區(qū)41個(gè)黑木耳供試菌株進(jìn)行RAPD和酯酶同工酶指紋圖譜的分析還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]卯曉嵐. 中國(guó)蕈菌[M]. 北京：科學(xué)出版社，2009：647-652.

[2]陳文強(qiáng)，王進(jìn)，鄧百萬，等. 秦巴山區(qū)黑木耳主要栽培種內(nèi)原生質(zhì)體分離與融合[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2014，33（8）：856-864.

[3]Peng X B，Li Q，Ou L N，et al. GC-MS，F(xiàn)T-IR analysis of black fungus polysaccharides and its inhibition against skin aging in mice[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2010，47（2）：304-307.

[4]Nguyen T L，Chen J，Hu Y L，et al. In vitro antiviral activity of sulfated Auricularia auricula polysaccharides[J]. Carbohydrate Polymers，2012，90（3）：1254-1258.

[5]Nguyen T L，Wang D Y，Hu Y L，et al. Immuno-enhancing activity of sulfated Auricularia auricula polysaccharides[J]. Carbohydrate Polymers，2012，89（4）：1117-1122.

[6]Tang L H，Xiao Y，Li L，et al. Analysis of genetic diversity among Chinese Auricularia auricula cultivars using combined ISSR and SRAP markers[J]. Current Microbiology，2010，61（2）：132-140.

[7]李媛媛，隋玉龍，牛淑力，等. SCAR標(biāo)記在黑木耳栽培菌株分類鑒定中的應(yīng)用[J]. 菌物研究，2013，11（3）：182-185，189.

[8]張旭，李倩，劉華晶，等. SRAP和ITS分子標(biāo)記在大興安嶺地區(qū)野生黑木耳遺傳多樣性上的應(yīng)用[J]. 黑龍江科學(xué)，2013，4（4）：17-21.

[9]唐利華，郭倩，王瑞娟，等. 中國(guó)黑木耳主要栽培菌株酯酶同工酶的研究[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，2007，14（4）：37-40.

[10]胡能書，萬賢國(guó).同工酶技術(shù)及其應(yīng)用[M]. 長(zhǎng)沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1985：59-76.

[11]鄭素月，張?；? 同工酶技術(shù)及其在食用菌種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用與進(jìn)展[J]. 邯鄲農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2004，21（3）：16-18.

[12]張欣倪，王鴻磊，丁強(qiáng)，等. 國(guó)外引進(jìn)雙孢菇菌種與國(guó)內(nèi)栽培菌種的 RAPD和酯酶同工酶指紋圖譜分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（7）：254-256.

[13]Bian Y B，Wu K Y，Wu C S. Genetic analysis of isozyme loci of intraspecific hybrid in Auricularia auricula[J]. Acta Genetica Sinica，2003，30（1）：76-80.

[14]韋仕巖，王燦琴，覃曉娟，等. 金福菇菌株的酯酶同工酶分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2014，33（5）：1025-1030.

[15]隋玉龍，宋慧，杜金，等. 靈芝栽培菌株酯酶同工酶的酶譜多樣性[J]. 菌物研究，2013，11（2）：136-140.

[16]彭浩，陳文強(qiáng)，鄧百萬，等. 陜南10株黑木耳主要栽培種酯酶同工酶的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：193-196.