王蕾++羅才林++徐德林+錢剛

摘要：Δ6-脂肪酸脫氫酶（Δ6 desaturase，D6D）是不飽和脂肪酸合成途徑中的限速酶。以高等植物千里光為材料，通過(guò)構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)克隆得到脂肪酸脫氫酶基因（D6D），明確了D6D基因的氨基酸保守基元序列（conserved sequence motif，CSM）對(duì)蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域的決定作用。結(jié)果顯示，千里光D6D基因由466個(gè)氨基酸殘基組成；預(yù)測(cè)蛋白分子量為53.40 ku，理論等電點(diǎn)為8.48；進(jìn)化樹(shù)和序列比對(duì)結(jié)果提示3個(gè)富含His的保守基元序列（HisⅠ-片段、HisⅡ-片段、HisⅢ-片段）在不同物種中表現(xiàn)出高度保守性；三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，D6D基因的保守結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)類似于細(xì)胞色素（cytochrome，cyt）b5的血紅素結(jié)合區(qū)是形成底物結(jié)合部位和酶催化活性中心的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：千里光；脂肪酸脫氫酶（D6D基因）；保守基元序列（CSM）；三維結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)： S567.23+9.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0073-05

收稿日期：2015-11-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31560087）；貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)基金（編號(hào)：黔省專合字2008-61號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：王蕾（1991—），女，黑龍江五大連池人，碩士研究生，主要從事藥用植物分子遺傳學(xué)研究。E-mail：1807840035@qq.com。

通信作者：錢剛，博士，教授，主要從事藥用植物分子遺傳學(xué)研究。E-mail：pengjiaqiong@163.com。脂肪酸脫氫酶是多不飽和脂肪酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，分為可溶性脫氫酶和膜結(jié)合脫氫酶，其中膜結(jié)合脫氫酶又可分為羧基定向的脂肪酸脫氫酶（“frond-end”脫氫酶）和甲基定向的脂肪酸脫氫酶[1]。脂肪酸脫氫酶結(jié)構(gòu)上都有3個(gè)保守的組氨酸富集區(qū)，除此之外羧基定向的脫氫酶N端還有1個(gè)類似于細(xì)胞色素b5 Cytb5的血紅素結(jié)合區(qū)（HPGG）[2-3]。

Δ6-脂肪酸脫氫酶（D6D）屬于羧基定向的膜結(jié)合脫氫酶，它以NADH、細(xì)胞色素b5氧化還原酶和細(xì)胞色素b5作為電子供體催化甘油脂中的脂肪酸脫氫[4]。Δ6-脂肪酸脫氫酶具有催化亞油酸、α-亞麻酸分別脫氫形成γ亞麻酸和十八碳四烯酸的功能[5]。

千里光（Senecio scandens Buch.-Ham. ex D. DO）為菊科（Compositae），屬多年生草本植物，它是中國(guó)傳統(tǒng)中藥之一，具有清熱解毒、明目、殺蟲(chóng)、保肝、涼血、驅(qū)風(fēng)除濕、抗菌、抗鉤端螺旋體等諸多功效[6-7]。迄今為止，已經(jīng)從藍(lán)細(xì)菌[8]、黑茶藨子[9]、深黃被孢菌[10]、高山被孢菌[11]、月見(jiàn)草[12]、假狼紫草[13]、雅致枝霉[14]、卷枝毛霉[15]、少根根霉[16]中克隆到Δ6-脂肪酸脫氫酶。盡管Δ6-脂肪酸脫氫酶基因在微生物和植物等不同物種中已有報(bào)道[1]，目前，關(guān)于D6D基因高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的研究尚少，該基因在菊科植物的相關(guān)研究也未見(jiàn)報(bào)道。本研究率先開(kāi)展藥用植物千里光Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的功能研究，分析了該蛋白理化性質(zhì)和保守基序?qū)δ芙Y(jié)構(gòu)域的決定作用，為深入了解高等植物多不飽和脂肪酸（PUFAs）合成的次生代謝途徑和蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料千里光資源（SC-36）系筆者所在課題組采自貴州省遵義地區(qū)野生種。

1.2方法

1.2.1千里光全長(zhǎng)cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建按照RNA提取試劑盒說(shuō)明提取千里光葉片組織的總RNA，采用SMART方法構(gòu)建了千里光的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)[17]，隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序（華大基因）。

1.2.2D6D基因生物信息學(xué)的分析依據(jù)測(cè)序結(jié)果，通過(guò)NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）的BLAST進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，并利用ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析開(kāi)放閱讀框；采用Expasy ProtParam程序（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)和氨基酸組成；使用MEGA 5.0軟件鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)；依據(jù)軟件DNAMAN進(jìn)行多物種氨基酸序列比對(duì)并確定蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域；使用在線工具SOPM（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopm.html）對(duì)千里光D6D基因進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；通過(guò)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank和Conserved domains分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域；將氨基酸序列信息提交（European Bioinformatics Institute（http：//www.isb-sib.ch），采用同源模型服務(wù)軟件SWISS-MODEL構(gòu)建D6D基因的3-D結(jié)構(gòu)[17]，根據(jù)最小疊合法利用Swiss-Pdb Viewer軟件對(duì)3-D結(jié)構(gòu)進(jìn)行修正和疊合[18]。

2結(jié)果與分析

2.1千里光D6D基因的理化性質(zhì)

從表1可以看出，該千里光D6D基因的分子量為 53.40 ku，理論等電點(diǎn)pI為8.48，不穩(wěn)定系數(shù)為42.98，表明該千里光D6D基因狀態(tài)不穩(wěn)定；脂溶指數(shù)為90.58；平均疏水指數(shù)為 0.078。該千里光D6D基因由20種氨基酸組成，亮氨酸含量較高，為12.0%，不含脯氨酸和硒半胱氨酸；原子組成為C2462H3694N640O64S25。

2.2D6D基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 5.0軟件，選擇NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1）。

結(jié)果表明，D6D基因與鉤柱花草（XP_003588984.1）、苜蓿（ABU98945.1）處于同一進(jìn)化分支上，表明它與二者親緣關(guān)系較近；與月見(jiàn)草（ACB47482.1）、野生大豆（KHN01208.1）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3D6D基因的保守基序分析

根據(jù)D6D基因遺傳進(jìn)化樹(shù)，選擇包含千里光在內(nèi)的5個(gè)親緣關(guān)系差異最大的物種進(jìn)行序列比對(duì)。序列比對(duì)結(jié)果顯示，這5個(gè)親緣關(guān)系差異最顯著的物種表現(xiàn)出高度同源性，同源性為76.31%。序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)富含組氨酸的保守基元序列HisⅠ-片段、HisⅡ-片段、HisⅢ-片段和N端的1個(gè)類似于細(xì)胞色素b5（Cytb5）的血紅素結(jié)合區(qū)（HPGG）在不同物種中表現(xiàn)出高度保守性（圖2）。

2.4D6D基因二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

使用在線工具SPOM分別對(duì)這5個(gè)物種的D6D基因進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，D6D基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、線性結(jié)構(gòu)和自由卷曲等4種基本結(jié)構(gòu)組成（表2），其中不同物種的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成比例都十分相近，例如α-螺旋的比例最高，自由卷曲的組成比例次之，β-轉(zhuǎn)角的含量最低。

結(jié)果表明，酶脫氫所共有的3個(gè)組氨酸保守區(qū)，分別在氨基酸序列的172～176、209～213、395～402處。結(jié)合D6D基因保守基序形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使在親緣關(guān)系相距最遠(yuǎn)的5個(gè)物種中，無(wú)論是保守基序還是非保守基序所形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)都非常相近（圖3）。

2.5D6D基因的保守結(jié)構(gòu)域與三維結(jié)構(gòu)比對(duì)分析

利用Blast搜索高等植物脂肪酸脫氫酶功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，D6D是羧基定向的脂肪酸脫氫酶，它包含3個(gè)組氨酸保守結(jié)構(gòu)域，分別為HXXXH、HXX（X）HH、H/QXX（X）HH，其N端存在類似于細(xì)胞色素b5（Cytb5）的血紅素結(jié)合區(qū)（HPGG） （圖2），這也在D6D結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)圖中得到進(jìn)一步證明（圖4）。三維結(jié)構(gòu)結(jié)果表明，包括千里光在內(nèi)的5個(gè)遺傳差異最為顯著的物種中，D6D基因具有高度相似的三維結(jié)構(gòu)。如圖5所示，在3-D結(jié)構(gòu)中，D6D基因結(jié)構(gòu)成分以α-螺旋和自由卷曲為主；3個(gè)組氨酸保守區(qū)以及類似于細(xì)胞色素b5（Cytb5）的血紅素結(jié)合區(qū)（HPGG）是形成底物結(jié)合部位和酶催化活性中心的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

3結(jié)論與討論

1993年，Reddy等首先從1株產(chǎn)6，9，12-十八碳三稀酸的藍(lán)細(xì)菌（Synechocystis sp. PCC6803）中克隆得到Δ6-脂肪酸脫氫酶基因，并在Δ6-脂肪酸脫氫酶缺陷的藍(lán)細(xì)菌（Anabaena sp. PCC7120）中得到功能性表達(dá)[8]。這一科研成果為后續(xù)脂肪酸脫氫酶的深入研究奠定了基礎(chǔ)。目前，通過(guò) cDNA 文庫(kù)篩選、cDNA文庫(kù)隨機(jī)測(cè)序和cDNA末端擴(kuò)增技術(shù)（RACE）等多種方法已經(jīng)從動(dòng)植物和真菌等不同生物中克隆到Δ6-脂肪酸脫氫酶基因[19]。本研究是基于提取并且純化千里光葉片mRNA構(gòu)建的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)[20]，表明D6D基因合成中產(chǎn)物對(duì)高等植物千里光有重要作用。目前，可以推測(cè)D6D是決定千里光合成多不飽和脂肪酸的關(guān)鍵基因之一。但由于大部分高等植物不能合成Δ6位脫氫的脂肪酸，所以D6D基因在高等植物中的具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

研究證實(shí)，用蛋白質(zhì)氨基酸序列所構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)分支不僅可以反映物種間的親緣關(guān)系，還可以作為蛋白功能相關(guān)性評(píng)價(jià)的依據(jù)，這是因?yàn)橹参镌陂L(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境的進(jìn)化過(guò)程中，執(zhí)行相關(guān)生理功能的基因因其重要的保護(hù)作用會(huì)表現(xiàn)得相對(duì)保守[21-22]。本研究構(gòu)建了D6D基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)，選擇了與千里光親緣關(guān)系差異較大的4個(gè)物種進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能分析，發(fā)現(xiàn)其基元序列變異性較高，說(shuō)明在代謝過(guò)程中可以有其他代謝途徑將D6D基因替代，同時(shí)，這種較高的變異性也可以加速物種的進(jìn)化，說(shuō)明并不是所有生物體內(nèi)都必須含有D6D基因。

為準(zhǔn)確分析基元序列特征，本研究選擇與高等植物千里光親緣關(guān)系差異最為顯著的4個(gè)物種，由此可見(jiàn)，該保守基序是構(gòu)成羧基定向的膜結(jié)合脫氫酶功能域的基本結(jié)構(gòu)單位，通過(guò)保守結(jié)構(gòu)域的分析也證實(shí)了這一點(diǎn)。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)D6D的N端和C端部分缺乏明顯的同源性，但中部序列相對(duì)保守，含有3個(gè)極度保守的組氨酸富集區(qū)。Fox等提出，這3個(gè)保守區(qū)可能參與酶活性中心位點(diǎn)的形成，這一點(diǎn)已經(jīng)在二價(jià)鐵酶中得到驗(yàn)證[23]。D6D基因除了有這3個(gè)組氨酸富集區(qū)以外，在其N末端的1個(gè)類似Cytb5的亞鐵血紅素結(jié)合區(qū)，刪除這段特殊序列區(qū)，或者對(duì)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，都會(huì)導(dǎo)致酶功能的紊亂[24]，同時(shí)根據(jù)其基元序列，發(fā)現(xiàn)D6D基因的保守基序以及HPGG血紅素結(jié)合區(qū)氨基酸片段高度保守，進(jìn)一步證實(shí)D6D基因底物結(jié)合部位和酶催化活性中心的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是3個(gè)組氨酸保守結(jié)構(gòu)域和1個(gè)類似于細(xì)胞色素b5的結(jié)構(gòu)域。除此之外，Δ6-脂肪酸脫氫酶還有2個(gè)特殊的組氨酸H53和H76，它們?cè)讦?-脂肪酸脫氫酶中的位置和血紅素上的2個(gè)組氨酸在細(xì)胞色素中位置一致；推斷這2個(gè)組氨酸與血紅素的穩(wěn)定性有關(guān)；對(duì)His53HPGG56序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)脂肪酸脫氫酶存在β-折疊，這樣可以使His53更容易結(jié)合于血紅素上而發(fā)揮Δ6-脂肪酸脫氫酶的活性[20]，證明其三維結(jié)構(gòu)中存在β-折疊的重要性。本研究為進(jìn)一步闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)性，依據(jù)氨基酸的保守序列對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白進(jìn)行3-D同源建模[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)，D6D基因保守結(jié)構(gòu)域是以α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相互作用形成的獨(dú)立結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步折疊形成蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)[27]，是脂肪酸脫氫酶底物結(jié)合位點(diǎn)和催化位點(diǎn)功能域的基本單位；千里光D6D基因所形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)較松散，表明D6D基因在形成四級(jí)結(jié)構(gòu)的過(guò)程中，須要結(jié)合更大官能團(tuán)的輔酶或輔基，抑或可為輔酶或輔基提供多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；意味著高等植物D6D基因在催化多不飽和脂肪酸的反應(yīng)過(guò)程中，有利于結(jié)合并且轉(zhuǎn)運(yùn)較大基團(tuán)的反應(yīng)底物。

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