韓翰，徐佳

（沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.生物化學(xué)教研室；2.病原生物學(xué)教研室，沈陽 110034）

?

SAHA和TRAIL聯(lián)合使用對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA?MB?231生長狀態(tài)的影響

韓翰1，徐佳2

（沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.生物化學(xué)教研室；2.病原生物學(xué)教研室，沈陽 110034）

摘要目的實(shí)時(shí)觀測辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA）和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）聯(lián)合使用對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA?MB?231生長狀態(tài)的影響。方法應(yīng)用實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析系統(tǒng)（RTCA）動(dòng)態(tài)監(jiān)測SAHA和TRAIL聯(lián)合使用對(duì)乳腺癌MDA?MB?231細(xì)胞生長狀況的影響，并通過BiostationIM活細(xì)胞工作站收集各種處理因素對(duì)MDA?MB?231細(xì)胞增殖干擾作用的形態(tài)學(xué)證據(jù)。結(jié)果xCELLigence RTCA顯示SAHA和TRAIL具有協(xié)同抑制MDA?MB?231細(xì)胞生長的作用，其中50 ng/mL TRAIL與5 μmol/L SAHA聯(lián)合作用效果最佳?；罴?xì)胞工作站顯示SAHA和TRAIL聯(lián)合處理對(duì)MDA?MB?231細(xì)胞生長的抑制效果較SAHA或TRAIL單獨(dú)處理更顯著。結(jié)論SAHA和TRAIL聯(lián)合使用對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA?MB?231的生長具有協(xié)同抑制作用。

關(guān)鍵詞辛二酰苯胺異羥肟酸；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體；三陰性乳腺癌細(xì)胞

網(wǎng)絡(luò)出版地址

乳腺癌是嚴(yán)重影響女性健康的最常見惡性腫瘤之一［1?2］。在臨床上，將雌激素受體（estrogen re?ceptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）及人表皮生長因子受體（human epidermal growth fac?tor receptor?2，HER?2）均不表達(dá)的乳腺癌稱為三陰性乳腺癌。它以惡性程度高、侵襲性強(qiáng)及預(yù)后差為主要特征，是目前乳腺癌治療的難點(diǎn)之一［3?4］。由于不表達(dá)ER及HER?2，三陰性乳腺癌不能從內(nèi)分泌治療和抗HER?2的靶向治療中獲益，因此，尋找新的治療靶點(diǎn)成為三陰性乳腺癌研究的熱點(diǎn)［5］。

研究［6?7］顯示，組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑辛二酰苯胺異羥肟酸（su?beroylanilide hydroxamic acid，SAHA）可通過抑制HDAC活性，誘導(dǎo)靶細(xì)胞中組蛋白高度乙?；?，啟動(dòng)某些特異性基因的表達(dá)，而達(dá)到阻斷腫瘤生長的目的。有文獻(xiàn)［8］指出，SAHA可誘導(dǎo)MCF?7、MDA?MB?231、MDA?MB?435、SKBr?3等乳腺癌細(xì)胞的凋亡。但近年來的研究證明，SAHA濃度過高時(shí)對(duì)細(xì)胞具有較大的毒副作用。另外，SAHA在體內(nèi)的半衰期短、易代謝，長期使用會(huì)產(chǎn)生不同程度的耐藥性。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF?related apop?tosis inducing ligand，TRAIL）是1995年WILEY等［9］發(fā)現(xiàn)的一種凋亡分子，為Ⅱ型膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子（tumor necrosis factors，TNF）家族，能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞與轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生凋亡，可特異性地抑制腫瘤細(xì)胞的生長，對(duì)正常細(xì)胞無毒性作用，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究擬實(shí)時(shí)觀測SAHA和TRAIL聯(lián)合使用對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA?MB?231細(xì)胞生長狀態(tài)的影響，以期為三陰性乳腺癌的臨床治療提供有價(jià)值的候選方案。

1　材料與方法

1.1材料

人乳腺癌細(xì)胞株MDA?MB?231購自美國ATCC細(xì)胞庫；Leibovitz’s L?15培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素及鏈霉素均購自美國Thermo公司；SAHA購自美國Sigma?Aldrich公司；人重組TRAIL蛋白購自美國Pe?protech公司；CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒購自美國Promega公司；Annexin?V?FLUOS staining kit購自美國Roche公司；其他化學(xué)試劑購自美國Sigma?Aldrich公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：將人乳腺癌MDA?MB?231細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的Leibovitz’s L?15培養(yǎng)基中。

1.2.2實(shí)時(shí)細(xì)胞增殖檢測：將乳腺癌MDA?MB?231細(xì)胞（1×104/mL）接種于xCELLigence實(shí)時(shí)無標(biāo)記動(dòng)態(tài)細(xì)胞分析系統(tǒng)的E?Plate 96孔板（Roche公司）中，細(xì)胞無血清同步化處理后，各孔分別加入不同濃度的SAHA（0，0.5，1，2，5，10，20，50 μmol/L）以及TRAIL（0，5，10，20，30，40，50，100 ng/mL）進(jìn)行孵育，以DMSO為對(duì)照組。通過xCELLigence系統(tǒng)每孔中細(xì)胞指數(shù)（cell index，CI）的動(dòng)態(tài)變化了解0～72 h 內(nèi)MDA?MB?231細(xì)胞的生長狀況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3RTCA實(shí)時(shí)分析系統(tǒng)檢測結(jié)果的驗(yàn)證：同時(shí)利用CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Prolifera? tion Assay試劑盒驗(yàn)證實(shí)時(shí)細(xì)胞增殖檢測結(jié)果。將1×104/mL MDA?MB?231細(xì)胞接種于96孔板各孔中，細(xì)胞無血清同步化處理24 h后，按1.2.2方法加入不同濃度的SAHA和TRAIL共同孵育。MDA?MB?231細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48 h后進(jìn)行MTT測定，了解細(xì)胞增殖的情況。

1.2.4實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像：將乳腺癌MDA?MB?231細(xì)胞（5×105/mL）接種于BioStationIM活細(xì)胞工作站μ?Slide 4 Well（Nikon公司）各孔中，待細(xì)胞無血清同步化處理后，加入SAHA和TRAIL共同孵育48 h。設(shè)定BioStationIM活細(xì)胞工作站以相差模式、總拍攝時(shí)長48 h、間隔12 h示蹤μ?Slide各孔中MDA?MB?231細(xì)胞的生長狀況，實(shí)時(shí)收集各處理因素對(duì)細(xì)胞增殖干擾的形態(tài)學(xué)證據(jù)。

1.2.5細(xì)胞凋亡熒光檢測：將MDA?MB?231細(xì)胞（5× 105/mL）接種于12孔板中，同步化處理后，加入SAHA和TRAIL與MDA?MB?231細(xì)胞分別孵育0、4、12、24、36、48 h。向孵育后的細(xì)胞分別加入100 μL Annexin?V?FLUOS熒光染液，室溫靜置15 min后，應(yīng)用Leica DMI6000B顯微鏡進(jìn)行熒光觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示。采用單因素方差分析比較多組數(shù)據(jù)，采用t檢驗(yàn)對(duì)比分析對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組之間的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1SAHA和TRAIL對(duì)乳腺癌MDA?MB?231細(xì)胞增殖的影響

通過xCELLigence RTCA分析系統(tǒng)實(shí)時(shí)觀測0～50 μmol/L SAHA對(duì)MDA?MB?231細(xì)胞生長狀態(tài)的影響，結(jié)果如圖1A所示：未行SAHA處理的細(xì)胞，隨著時(shí)間的推移，其CI持續(xù)增加，48 h到達(dá)生長平臺(tái)期，說明MDA?MB?231細(xì)胞生長狀況良好；而經(jīng)不同濃度SAHA作用的MDA?MB?231細(xì)胞，隨著處理時(shí)間的延長、SAHA濃度的增加，CI值逐漸下降，細(xì)胞生長被抑制。其中，高濃度SAHA（20～50 μmol/L）作用24 h即可表現(xiàn)出明顯的抑制效果，作用48 h后，細(xì)胞已基本死亡。而低濃度實(shí)驗(yàn)組（0.5～2.0μmol/L）細(xì)胞曲線維持穩(wěn)定，細(xì)胞生長狀況未受明顯影響，SAHA作用效果不明顯。當(dāng)SAHA濃度達(dá)到5.0 μmol/L時(shí)，隨著作用時(shí)間的延長，細(xì)胞效應(yīng)曲線持續(xù)下降，細(xì)胞生長被抑制，當(dāng)作用時(shí)間達(dá)到48 h時(shí)，CI曲線下降幅度與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SAHA的抑制作用達(dá)到最佳。而作為對(duì)照的DMSO對(duì)MDA?MB?231細(xì)胞增殖作用的影響如圖1B所示：加入不同濃度的DMSO后，MDA?MB?231細(xì)胞生長狀況基本良好，CI持續(xù)增加，DMSO未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性作用。

圖1　xCELLigence RTCA分析系統(tǒng)實(shí)時(shí)觀測SAHA和DMSO對(duì)乳腺癌MDA?MB?231細(xì)胞增殖的影響Fig.1　Real?time cell proliferation assays on the effects of SAHA and DMSO on proliferation of breast cancer cells MDA?MB?231

將不同濃度TRAIL（0～100 ng/mL）與MDA?MB?231細(xì)胞共同培養(yǎng)于xCELLigence RTCA系統(tǒng)中，結(jié)果顯示TRAIL對(duì)MDA?MB?231細(xì)胞的抑制效果顯著（圖2 A）。

圖2　xCELLigence RTCA分析系統(tǒng)實(shí)時(shí)觀測SAHA聯(lián)合TRAIL對(duì)乳腺癌MDA?MB?231細(xì)胞增殖的影響Fig.2　Real?time cell proliferation assays of the effects of combined treatment with TRAIL and SAHA on proliferation of breast cancer cells MDA?MB?231

2.2SAHA和TRAIL聯(lián)合作用對(duì)乳腺癌MDA?MB?231細(xì)胞增殖的影響

以0～100 ng/mL TRAIL和5 μmol/L SAHA聯(lián)合作用于MDA?MB?231細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖受到明顯抑制，較TRAIL單獨(dú)作用時(shí)效果更顯著，具有聯(lián)合效應(yīng)。如圖2B所示：5 μmol/L SAHA與不同濃度TRAIL聯(lián)合作用細(xì)胞24 h后，CI曲線趨于水平并開始下行，說明MDA?MB?231細(xì)胞生長已受到抑制，細(xì)胞增殖處于停滯狀態(tài)，而隨著SAHA和TRAIL聯(lián)合作用時(shí)間的延長，CI曲線下降明顯。其中，TRAIL濃度為50 ng/mL、作用時(shí)間為48 h時(shí)聯(lián)合作用效果最強(qiáng)，且該結(jié)果由MTT檢測進(jìn)一步得到確認(rèn)（圖2C、2D）。

2.3TRAIL和SAHA聯(lián)合作用對(duì)乳腺癌MDA?MB?231細(xì)胞形態(tài)的影響

應(yīng)用BioStationIM活細(xì)胞工作站觀察SAHA和TRAIL對(duì)乳腺癌MDA?MB?231細(xì)胞生長狀況的影響，結(jié)果如圖3、4所示：隨著時(shí)間的推移，DMSO對(duì)照組在處理48 h后細(xì)胞形態(tài)正常，生長狀況良好，鋪滿率達(dá)90%；而SAHA、TRAIL單獨(dú)處理后的乳腺癌細(xì)胞呈現(xiàn)不同的形態(tài)學(xué)改變，SAHA處理MDA?MB?231細(xì)胞12 h后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡改變，細(xì)胞變圓、固縮、破碎，體積減小，凋亡熒光檢測發(fā)現(xiàn)大量熒光染色的凋亡細(xì)胞，而TRAIL處理的細(xì)胞在24 h時(shí)才呈現(xiàn)出較明顯的凋亡形態(tài)學(xué)變化。SAHA和TRAIL聯(lián)合作用對(duì)MDA?MB?231細(xì)胞形態(tài)改變的協(xié)同效果明顯，接種細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的貼壁生長均受到影響，處理12 h后即出現(xiàn)大量圓形破碎細(xì)胞，24 h后超過50%的細(xì)胞已經(jīng)凋亡，熒光顯微鏡下呈現(xiàn)大量片狀熒光染色的凋亡細(xì)胞。

圖3　顯微鏡下觀察SAHA聯(lián)合TRAIL對(duì)乳腺癌MDA?MB?231細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.3　Microscopic observation of the effects of combination treatment of TRAIL and SAHA on morphology of breast cancer cells MDA?MB?231

3　討論

乳腺癌是一種具有高度異質(zhì)性的腫瘤，包括病理特征與疾病預(yù)后各不相同的5種分子亞型［10?12］。其中，三陰性乳腺癌占所有乳腺癌的10%～15%。因其ER、HER?2受體表達(dá)均為陰性，現(xiàn)有的內(nèi)分泌治療和HER?2靶向治療都不適用于三陰性乳腺癌，尋找新的治療靶點(diǎn)成為三陰性乳腺癌研究的重要挑戰(zhàn)。

圖4　熒光檢測SAHA聯(lián)合TRAIL對(duì)乳腺癌MDA?MB?231細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.4　The fluorescent detection of the effects of combined treatment of TRAIL and SAHA on morphology of breast cancer cells MDA?MB?231

HDACs的異常表達(dá)和活化存在于許多人類疾病中，尤其是腫瘤和炎癥相關(guān)的疾病。研究［13］表明，乳腺細(xì)胞功能異常時(shí)HDACs的活性明顯增強(qiáng)，組蛋白處于低乙酰化狀態(tài)，基因表達(dá)平衡狀態(tài)被破壞，某些調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡的基因表達(dá)失衡，導(dǎo)致乳腺癌的形成。

近年來，大量研究證實(shí)SAHA可結(jié)合HDACs的催化位點(diǎn)，通過抑制HDACs活性促進(jìn)乙?；M蛋白增加，造成癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄過程異常，誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化，阻滯癌細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，隨著處理時(shí)間的延長及SAHA濃度的增加，三陰性乳腺癌MDA?MB?231細(xì)胞CI曲線下降，細(xì)胞生長受到抑制。其中，高濃度SAHA（20～50 μmol/L）作用MDA?MB?231細(xì)胞24 h即可顯現(xiàn)較明顯的抑制效果，說明高濃度SAHA具有顯著的抗腫瘤效應(yīng)。但也有研究顯示濃度過高的SAHA對(duì)正常細(xì)胞具有較大的毒性作用。同時(shí)，SAHA在體內(nèi)的半衰期短、易代謝，長期使用會(huì)產(chǎn)生不同程度的耐藥。而以SAHA為基礎(chǔ)的聯(lián)合用藥一方面可降低單藥用藥劑量、保護(hù)人體正常細(xì)胞，另一方面，還可有效地協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞，因此，尋找合適的配伍方案成為新的研究熱點(diǎn)［14?16］。

TRAIL能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞與轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞無毒性作用，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。因此，本研究將SAHA與TRAIL聯(lián)合作用于乳腺癌MDA?MB?231細(xì)胞，研究其對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長的聯(lián)合作用。MDA?MB?231是TRAIL敏感細(xì)胞系，xCELLigence RTCA結(jié)果顯示TRAIL對(duì)MDA?MB?231的抑制效果明顯。0～100 ng/mL TRAIL和5 μmol/L SAHA聯(lián)合作用于MDA?MB?231細(xì)胞，協(xié)同抑制效果顯著。其中，TRAIL濃度為50 ng/mL、作用時(shí)間為48 h時(shí)，協(xié)同抑制效果最強(qiáng)。形態(tài)學(xué)研究結(jié)果顯示，SAHA和TRAIL聯(lián)合作用MDA?MB?231細(xì)胞12 h后，可見大量圓形破碎細(xì)胞，24 h時(shí)超過50%的細(xì)胞已經(jīng)凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，SAHA和TRAIL聯(lián)合應(yīng)用對(duì)三陰性乳腺癌MDA?MB?231細(xì)胞的生長具有協(xié)同抑制作用，這2種藥物的聯(lián)合使用具有良好的臨床應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

［1］COUTO E，SANDIN S，L?F M，et al.Mediterranean dietary pattern and risk of breast cancer［J］.PLoS One，2013，8（2）：e55374.

［2］ZHOU W，WANG G，GUO S.Regulation of angiogenesis via Notch signaling in breast cancer and cancer stem cells［J］.Biochim Bio?phys Acta，2013，1836（2）：304-320.

［3］PEROU CM，S?RLIE T，EISEN MB，et al.Molecular portraits of hu?man breast tumours［J］.Nature，2000，406（6797）：747-752.

［4］CRISCITIELLO C，AZIM HA，SCHOUTEN PC，et al.Understand?ing the biology of triple?negative breast cancer［J］.Ann Oncol，2012，23（6）：vi13-vi18.

［5］YIN WJ，LU JS，DI GH，et al.Clinicopathological features of the tri?ple?negative tumors in Chinese breast cancer patients［J］.Breast Cancer Res Treat，2008，115（2）：325-333.

［6］夏根玉，陳斌.BRMS1、HDAC1、VEGF?C在乳腺癌組織中的表達(dá)及意義［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2010，48（9）：10-12.

［7］霍志軍，陳道瑾，李小榮，等.乳腺癌中HDAC1和ER的表達(dá)及意義［J］.實(shí)用腫瘤雜志，2007，22（5）：420-422.

［8］LEE YJ，WON AJ，LEE J，et al.Molecular mechanism of SAHA on regulation of autophagic cell death in tamoxifen?resistant MCF?7 breast cancer cells［J］.Int J Med Sci，2012，9（10）：881-893.

［9］WILEY SR，SCHOOLEY K，SMOLAK PJ，et al.Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis［J］.Immunity，1995，3（6）：673-682.

［10］CHARGARI C，TOILLON RA，MACDEMED D，et al.Concurrent hormone and radiation therapy in patients with breast cancer：what is the rationale？［J］.Lancet Oncol，2009，10（1）：53-60.

［11］HUDIS CA，GIANNI L.Triple?negative breast cancer：an unmet medical need［J］.Oncologist，2011，16（Suppl 1）：1-11.

［12］CHEANG MCU，VOUDUC D，BAJDIK C，et al.Basal?like breast cancer defined by five biomarkers has superior prognostic value than triple?negative phenotype［J］.Clin Cancer Res，2008，14（5）：1368-1376.

［13］GUI CY，NGO L，XU WS，et al.Histone deacetylase（HDAC）in?hibitor activation of p21WAF1 involves changes in promoter?asso?ciated proteins，including HDAC1［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（5）：1241-1246.

［14］LEE CK，WANG S，HUANG X，et al.HDAC inhibition synergisti?cally enhances alkylator?induced DNA damage responses and apoptosis in multiple myeloma cells［J］.Cancer Lett，2010，296 （2）：233-240.

［15］ZHANG QY，REN W，LI X，et al.Histone acetylation and multi?drug resistances of tumor cells［J］.J Mod Oncol，2011，19（5）：1022-1026.

（編輯王又冬）

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：

中圖分類號(hào)R329.24

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)0258-4646（2016）07-0591-06

DOI：10.12007/j.issn.0258?4646.2016.07.004

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81172509）；遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2013404）

作者簡介：韓翰（1982-），女，講師，博士研究生.

通信作者：徐佳，E-mail：toxujia@163.com

收稿日期：2015-11-12

Effects of Combination of SAHA and TRAIL on Proliferation of Triple?negative Breast Cancer Cell MDA?MB?231

HAN Han1，XU Jia2
（1.Department of Biochemistry，College of Basic Medical Science，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Department of Pathogenic Biology，Col?lege of Basic Medical Science，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China）

AbstractObjectiveTo investigate the effects of combined treatment of suberoylanilide hydroxamic acid（SAHA）and TNF?related apoptosis inducing ligand（TRAIL）on proliferation and morphology change of triple?negative breast cancer cell MDA?MB?231.MethodsThe effects of combination treatment of SAHA and TRAIL on proliferation and morphology change of MDA?MB?231 cells were monitored by RTCA.Morphology changes of MDA?MB?231 cells by different treatment factors were observed through time?lapse live cell imaging acquisition.ResultsReal?time cell proliferation assays showed that a synergistic effect were found when MDA?MB?231 cells were treated with combination of SAHA and TRAIL，and reached the best effect with 5 μmol/L SAHA and 50 ng/mL TRAIL.The results of time?lapse live cell imaging acquisition showed that the growth inhibition of MDA?MB?231 cells with combined treatment of SAHA and TRAIL were more obvious than that with treatment of SAHA or TRAIL alone.ConclusionThe combined treatment of SAHA and TRAIL induces a synergistic effect on growth inhibition in triple?negative breast cancer cell line MDA?MB?231.

Keywordssuberoylanilide hydroxamic acid；TNF?related apoptosis inducing ligand；triple?negative breast cancer cell