陸慧潔，陳　玲，邱平明（南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院法醫(yī)學系，廣東 廣州 510515）

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D21S11稀有等位基因落入相鄰基因座1例

陸慧潔，陳玲，邱平明
（南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院法醫(yī)學系，廣東 廣州 510515）

關鍵詞：法醫(yī)遺傳學；等位基因；短串聯(lián)重復序列；三帶型

1　案例

1.1簡要案情

建立基因檔案，送檢血液樣本一份。

1.2初次檢驗

采用 Chelex-100法提取 DNA，AmpFeSTR? SinofilerTM試劑盒（美國AB公司）進行PCR復合擴增，擴增體系和熱循環(huán)反應按試劑盒說明書進行，擴增產(chǎn)物在3130xl遺傳分析儀（美國AB公司）電泳，Genemapper ID v3.2軟件分析結(jié)果。D21S11基因座表現(xiàn)為純合子，D7S820基因座顯示為5/8/11三帶型，其中等位基因5的峰高略低于等位基因8和11的峰高（圖1）。

1.3復核檢驗

采用Chelex-100法提取DNA，GoldeneyeTM20A試劑盒［基點認知技術（北京）有限公司］進行PCR復合擴增，擴增體系和熱循環(huán)反應按試劑盒說明書進行，擴增產(chǎn)物在3130xl遺傳分析儀電泳，Genemapper ID v3.2軟件分析結(jié)果。參考Kline等［1］發(fā)表的D21S11基因座引物序列（F：5′-CCAGCTTCCCTGATTCTTCA-3′；R：5′-CACTGAGAAGGGAGAAACACTG-3′）進行單基因座擴增，擴增反應體系含12.5μL 2×Go Taq? Green Master Mix（美國Promega公司），正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板20 ng，加超純水至總體積為25 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，32個循環(huán)；72℃ 5min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠（T=6%，C= 3.3%）電泳，硝酸銀染色顯帶，56℃干膠過夜。從凝膠上剪下兩條目的等位基因條帶（包括標識峰條帶和未標識峰條帶），分別加入50μL超純水浸泡24h以上，吸取浸泡液再次進行單基因擴增，擴增體系總體積為50 μL，含2×Go Taq?Green Master Mix 25 μL，正、反向引物（10μmol/L）各2μL，等位基因浸泡液21μL，引物序列和熱循環(huán)反應條件同上。將上述PCR擴增產(chǎn)物和引物序列送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司廣州分公司進行序列測定。采用Chromas v1.62軟件（澳大利亞Technelysium公司）查看測序圖譜，用BioEdit Version 5.0.9軟件（加拿大Ibis Biosciences公司）比對測序結(jié)果。

結(jié)果顯示，綠色熒光標記的D7S820基因座分型為8/11，藍色熒光標記的D21S11基因座與D18S51基因座之間出現(xiàn)一個未標識的峰（圖2），根據(jù)片段長度將該等位基因判讀為40.3。單基因座擴增結(jié)果如圖3A所示，D21S11基因座檢出兩條等位基因條帶。目的等位基因測序結(jié)果，等位基因32的重復序列［TCTA］6［TCTG］5［TCTA］3TA［TCTA］3TCA［TCTA］2TCCATA ［TCTA］13與STRBase［2］相同，核心序列為TCTA與TCTG，重復序列中間有固定TA、TCA與TCCA的插入；稀有等位基因40.3的重復序列為［TCTA］5［TCTG］6［TCTA］3TA［TCTA］3TCA［TCTA］2TCCATA［TCTA］4TCA［TCTA］2TCCATA［TCTA］12TATCTA，與等位基因32相比，在第23個重復序列下游插入TCA［TCTA］2TCCATA［TCTA］12TATCTA（圖3B）。

2　討論

正常情況下，人常染色體一個STR基因座上有兩個等位基因，純合子圖譜表現(xiàn)為只有1條帶或1個峰，雜合子圖譜表現(xiàn)為2條帶或2個峰。在實際案件檢測中，單個STR基因座的分型圖譜有時會出現(xiàn)3條帶或3個峰的情況，這一現(xiàn)象被稱為三帶型（three-banded pattern）［3］。三帶型包括 Type1和Type2兩種類型，Type1表現(xiàn)為其中兩個峰的峰高之和約等于另一個峰，Type2表現(xiàn)為三個峰的峰高接近［4-5］。該案例用SinofilerTM試劑盒檢測時，D7S820基因座表現(xiàn)為三帶型，但其等位基因5的峰高較等位基因8和11低，且與D21S11基因座的等位基因32接近，不屬于上述兩種典型的三帶型類型。這種情形提示可能D21S11出現(xiàn)一個較大的稀有等位基因落在D7S820基因座等位基因梯度標準物（ladder）范圍內(nèi)，并被分析軟件自動判讀，導致D7S820基因座出現(xiàn)假三帶型。

在STR分型中常會遇到未被等位基因梯度標準物（ladder）所包含的新的等位基因，這被稱為分型標準物外（off-ladder allele，OL）等位基因或稀有等位基因［6］，其產(chǎn)生的原因一方面是由于電泳過程中發(fā)生漂移，另一方面原因是重復序列插入或缺失形成的復合結(jié)構。目前，已有文獻報道［7-9］，由于OL等位基因過大或過小落在相鄰的基因座ladder范圍內(nèi)，分析軟件錯誤標識或判讀稀有等位基因，形成假“三帶型”等位基因。因此，該案例用GoldeneyeTM20A試劑盒復核檢測，結(jié)果顯示D7S820基因座分型為8/11，D21S11基因座分型為32和D21S11與D18S51基因座之間的一個未標識峰；單基因座擴增驗證結(jié)果顯示D21S11基因座有兩條等位基因條帶；D21S11基因座基因測序結(jié)果證實了GoldeneyeTM20A試劑盒中的未標識峰是D21S11的稀有等位基因40.3，而在SinofilerTM試劑盒中被自動判讀為D7S820的等位基因5。因此，在判讀三帶型時要觀察等位基因峰高，并與相鄰基因座的等位基因峰高進行對比，特別是軟件自動讀出三帶型的情形下，極易發(fā)生誤判。

OL等位基因片段長度過大或過小落入相鄰基因座 ladder范圍內(nèi)的現(xiàn)象在 D13S325、D2S1338、 D3S1358等基因座也有報道［9-11］，所以峰高是DNA圖譜分析必不可少的一個觀察要素。實際檢案對于可疑等位基因峰，需采用其他試劑盒進行復核驗證，必要時進行單基因座擴增驗證后序列測定。上述案例顯示的稀有等位基因超出ladder范圍，且落入同色熒光的相鄰基因座ladder范圍內(nèi)，可造成兩個基因座同時錯誤分型，所以對這種異常的OL等位基因要特別關注和識別。

參考文獻：

［1］Kline MC，Hill CR，Decker AE，et al.STR sequence analysis for characterizing normal，variant，and null alleles［J］.Forensic Sci Int Genet，2011，5（4）：329-332.

［2］STRBase［DB/OL］.［2015-08-21］.http://www.cstl.nist. gov/div831/strbase/str_D21S11.htm.

［3］Crouse CA，Rogers S，Amiott E，et al.Analysis and interpretation of short tandem repeatmicrovariants and three-banded allele patterns using multiple allele detection systems［J］.J Forensic Sci，1999，44（1）：87-94.

［4］Lane AB.The nature of tri-allelic TPOX genotypes in African populations［J］.Forensic Sci Int Genet，2008，2（2）：134-137.

［5］陳玲，劉超，邱平明，等.常染色體STR基因座三帶型的觀察與分析［J］.中國法醫(yī)學雜志，2014，29（4）：316-318.

［6］陸惠玲，臺運春，劉超，等.PowerPlexTM16體系OL等位基因序列分析及命名探討［J］.法醫(yī)學雜志，2006，22（3）：186-189.

［7］Grubwieser P，Mühlmann R，Niederst?tter H，et al. Unusual variant alleles in commonly used short tandem repeat loci［J］.Int J Legal Med，2005，119（3）：164-166.

［8］Huel RL，Basi＇cL，Madacki-Todorovi＇cK，et al.Variant alleles，triallelic patterns，and point mutations observed in nuclear short tandem repeat typing of populations in Bosnia and Serbia［J］.Croat Med J，2007，48（4）：494-502.

［9］Chen W，Cheng J，Tong D，et al.Identification of a rare off-ladder allele of the D13S325 locus during paternity testing［J］.Leg Med（Tokyo），2014，16（1）：48-51.

［10］Heinrich M，F(xiàn)elske-Zech H，Brinkmann B，et al. Characterisation of variant alleles in the STR systems D2S1338，D3S1358 and D19S433［J］.Int J Legal Med，2005，119（5）：310-313.

［11］Raziel A，Oz C，Carmon AD，et al.Discordance at D3S1358 locus involving SGM PlusTMand the European new generation multiplex kits［J］.Forensic Sci Int Genet，2012，6（1）：108-112.

（本文編輯：柳燕）

中圖分類號：DF795.2

文獻標志碼：B

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.03.024

文章編號：1004-5619（2016）03-0239-02

作者簡介：陸慧潔（1988—），女，主要從事法醫(yī)物證學研究；E-mail：huijie_lu@sina.com

通信作者：邱平明，男，博士，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證學和毒品毒性機制研究；E-mail：qiupm@163.com

收稿日期：（2015-09-23）