張瑞艷+何艮+周慧慧

摘要：將植物乳酸菌P-8以滅活的形式添加到大菱鲆幼魚的兩種基礎飼料中，旨在研究滅活植物乳酸桿菌（HK-LP）對大菱鲆飼料中豆粕替代魚粉的影響。試驗結束時取血測定血清超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、堿性磷酸酶（ALP）、谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）活力和總蛋白（TP）、膽固醇（TCHO）、甘油三酯（TGK）含量。結果顯示，D因素和P因素在AST、ALP、TGK和SOD有顯著交互作用（P<0.05）。D因素ALT、TCHO、TP、TGK、MDA和SOD有顯著性影響（P<0.05）；P因素對SOD、ALP、AST、ALT、TGK和TP有顯著性影響（P<0.05），且對血清生化指標ALP、AST、ALT、TGK和TP有極顯著影響（P<0.01），血清TCHO、MDA呈下降趨勢，但未達到顯著水平（P>0.05），CAT呈上升趨勢，但未達到顯著水平（P>0.05）。由此得知，在豆粕替代45%魚粉蛋白飼料中添加一定濃度的滅活乳酸桿菌P-8對大菱鲆幼魚血清生化指標和抗氧化能力有顯著性影響。

關鍵詞：滅活植物乳酸桿菌P-8；大菱鲆；豆粕；抗氧化能力；血清生化指標

大菱鲆是原產(chǎn)于歐洲的一種天然良種，因其對生態(tài)環(huán)境的超強適應能力、快速的生長速度以及優(yōu)良的品質(zhì)，成為各國競相引種的對象。自從20世紀末我國水產(chǎn)科學家雷霽霖院士從英國引進以來，大菱鲆產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展并產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟和社會效益，中國目前已經(jīng)成為世界大菱鲆人工養(yǎng)殖大國。然而近些年來隨著人們對水產(chǎn)動物需求量的不斷攀升，魚粉卻出現(xiàn)產(chǎn)量下降價格飆升，魚粉短缺已成為一個全球性問題。因此水產(chǎn)飼料中植物飼料的使用受到高度的關注。豆粕由于其蛋白含量高、氨基酸相對平衡、價格合理[1]而成為重要的魚粉替代蛋白源。但是，豆粕中的胰蛋白酶抑制因子和血球凝集素等抗營養(yǎng)因子以及氨基酸的不平衡性和可利用性限制其在魚類飼料中的用量。研究表明，全脂大豆或浸提豆粕會抑制生長，降低飼料效率[2]。豆粕中的抗營養(yǎng)因子會損傷腸道[3]，影響腸道內(nèi)的微生態(tài)環(huán)境[4]，抑制消化酶的活性[5]，影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。某些含抗營養(yǎng)素的植物源飼料原料可引發(fā)急性中毒癥狀；但在正常飼喂條件下，通常只有長期攝食某種特定植物才會產(chǎn)生輕微的負面效應。這類效應包括干擾消化過程及生長、降低飼料效率、胰腺肥大癥、低血糖、肝功能障礙、異性生殖和免疫抑制。能否在低魚粉含量條件下尋找到一種促進生長的安全有效的添加劑顯得尤為重要。

最近飼料添加劑越來越多地用作魚類免疫刺激劑[6]，在這些添加劑里使用最廣泛和效果最顯著的就是益生菌。對益生菌的定義包括活的或者死的微生物細胞代謝產(chǎn)物，能夠調(diào)節(jié)動物腸道菌群和刺激免疫酶活，不一定是活菌，只要能對宿主產(chǎn)生益生作用[7]。有益生功能的細菌無論是以活菌形式添加[8-9]還是以滅活菌的形式添加[10-14]都顯示出積極的促健康性能。加熱滅活的植物乳酸桿菌（HK-LP）賦予了乳酸菌新的性能。乳酸菌是不耐高溫高壓的，但是HK-LP能夠抵抗飼料制粒過程中的高溫高壓，最近五年內(nèi)這種新性能在農(nóng)場動物飼料中得到廣泛應用[15-16]。由于口服活的益生菌可能會將活的細菌引進到開放水環(huán)境中，又引發(fā)人們對水產(chǎn)業(yè)新的擔憂。在這種擔憂下，滅活菌因為不會與其他的水生生物相互作用而不存在安全隱患，替代活菌制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖上嶄露頭角[12]。滅活菌和活菌在免疫反應方面的許多對比研究結果顯示加熱滅活的酪酸菌在鮸魚身上有明顯的免疫調(diào)節(jié)性能[17]；加熱滅活的創(chuàng)傷弧菌疫苗比福爾馬林滅活的疫苗在牙鲆身上能更好地引起免疫應答[18]；加熱滅活的小腸結腸炎耶爾森氏菌能夠保持小鼠免疫調(diào)節(jié)性能[19]。HK-LP用作小白鼠免疫刺激劑誘導小鼠產(chǎn)生白介素12和抗癌抗菌素，增加伽馬干擾素的生成，進而抑制病毒繁殖和其他的T細胞并活化啟動巨噬細胞吞噬作用[20]；日糧中添加HK-LP能夠提高健康成年人[21]和肉雞[16]的免疫力。

肉食性魚類不適應消化含高植物蛋白的飼料，其飼料中添加豆粕易引發(fā)其腸道炎癥。腸粘膜作為魚類免疫系統(tǒng)的第一道非特異性免疫屏障，受到損害后，致病菌會侵入機體。普遍認為腸道有益菌群和腸道上皮細胞間的相互作用在動物腸道粘膜免疫方面起了重要作用。乳酸菌通過生物拮抗作用改善試驗動物腸道微生態(tài)環(huán)境，增強腸道上皮細胞的屏障層，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，抑制有害菌的感染和腸內(nèi)腐敗。本試驗希望通過滅活植物乳酸桿菌的益生功能削弱豆粕帶來的消極作用，調(diào)節(jié)大菱鲆腸道健康，改善其營養(yǎng)狀況，促進大菱鲆幼魚生長，提高大菱鲆幼魚的免疫力，從而提高大菱鲆對豆粕這種植物蛋白源的耐受力，提高植物蛋白在肉食性魚類飼料中的替代比。

1材料和方法

1.1飼料制作

植物乳酸菌菌種由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程實驗室提供，菌種以凍干形式保存的，MRS肉湯培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h活化，80%甘油保存在-80 ℃冰箱中作為菌種保存?zhèn)溆谩RS瓊脂培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)48 h，挑取單菌落，接種于MRS肉湯培養(yǎng)基24 h，16 500 g離心10 min，PBS洗滌三次重懸，MRS瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)48～36 h計數(shù)。

分別以魚粉（粗蛋白71.58，粗脂肪9.6）和豆粕（粗蛋白55.60，粗脂肪 2.0）為主要蛋白源，小麥粉作為糖源，配置兩種基礎飼料（FM，SM），基礎配方見表1。在兩種基礎飼料中添加加熱滅活菌，添加劑量為107CFU/g和109CFU/g，配制出6種等氮等能的試驗飼料，依次分別對應命名為FM組：S0A0，S0A7，S0A9；SM組：S45A0，S45A7，S45A9。在飼料制作過程中，所有原料粉碎后過320μm篩網(wǎng)，各原料按配比定量后混合均勻，然后加入適量的水揉勻，經(jīng)F（Ⅱ）-26型雙螺桿擠條機（華南理工大學，廣州）加工制成硬顆粒飼料（1.5 mm×2.0 mm，2.5 mm×3.0 mm），105 ℃烘干至飼料水分含量為10%左右，用塑料袋包裝，保存于-20 ℃冰柜中備用。從不同區(qū)域隨機取幾粒飼料，PBS溶解離心取上清，MRS瓊脂培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)3 d，無菌落長出。

1.2實驗魚的來源、馴化與養(yǎng)殖管理

試驗在青島即墨七好生物科技有限公司進行。大菱鲆魚苗從當?shù)匾患矣鐖龇庇耐慌~苗。在開始正式實驗前，幼魚放于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)2周，并以基礎飼料FM飽食投喂，使之逐漸適應實驗飼料和養(yǎng)殖環(huán)境。實驗開始時，實驗魚饑餓24 h，然后稱質(zhì)量，并挑選出規(guī)格一致（平均初始體質(zhì)量為（7.82± 0.68）g的大菱鲆進行分組實驗。實驗在18個循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行，放養(yǎng)密度為30條/桶。每一桶為一組，每種飼料隨機投喂3組實驗魚。每天飽食投喂2次（7：00和18：00）。養(yǎng)殖周期 10周。每天記錄投飼量，如有死魚記錄數(shù)量并稱重。實驗期間海溫度為18～20 ℃，鹽度24‰～26‰，溶氧保持>7 mg/L。

1.3樣品收集

70 d生長實驗結束后，對實驗魚饑餓24 h，分別從每桶抽取5條魚，以1 mL無菌注射器從尾靜脈取血，室溫自然沉降2 h，然后4 ℃沉降4～6 h，分離血清并保存在-80 ℃冰箱，以備使用。

血清生化指標：血清送至湖北武漢長江水產(chǎn)研究所檢測，檢測指標包括谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽固醇（TCHO）、總蛋白（TP）、甘油三酯（TGK）。

免疫指標：血清超氧化物歧化酶（ superoxide dismutase，SOD ）、丙二醛（ malonaldehyde，MDA） 濃度、過氧化氫酶（catalase，CAT）采用相關的專用試劑盒測定（ 南京建成生物工程研究所，南京）。

1.4統(tǒng)計分析

實驗結果利用雙因素方差分析（two-way ANOVA），若兩個因素之間存在交互作用，則利用單因素方差分析考察所有處理組之間的差異，若差異顯著，再進行Turkeys 多重比較。如果HK-LP濃度對結果有顯著性影響，則利用單因素方差分析和Turkeys多重比較考察各濃度處理組各項指標之間的差異；當P<0.05時認為存在顯著性差異。所有數(shù)據(jù)都采用SPSS17.0軟件進行處理 。

5、誘食劑 （mg kg-1飼料）： 甜菜堿， 2； 硫代甜菜堿， 1； 蘇氨酸， 1； 丙氨酸 0.5； 5′-磷酸肌苷， 0.5.

2結果

2.1血清生化指標

D、P兩因素在血清指標ALT、TP、TCHO沒有交互作用。HK-LP占主要作用，在不考慮基礎飼料因素時，隨著HK-LP添加濃度的增加，ALT活性顯著降低。添加豆粕后TCHO顯著降低；同全魚粉組，TCHO 隨HK-LP濃度增加呈下降趨勢，但是作用不顯著（P>0.05）?？偟鞍缀侩S著HK-LP添加濃度增加而顯著增加（P<0.05）。在血清AST、ALP、TGK指標方面，D、P兩因素有交互作用（P<0.05）。豆粕45%替代組，隨著HK-LP濃度增加，AST活性顯著降低；全魚粉組，HK-LP三個處理間無顯著差異。S45R0組血清AST顯著高于S0R0（P<0.05），但添加HK-LP后S45R7和S45R9與對照組S0R0無顯著差異（P>0.05），即添加HK-LP使豆粕替代組的AST活力從顯著高于對照組變?yōu)榕c對照組無顯著差異。在同一飼料號組，ALP活力隨HK-LP濃度增加而顯著升高（P<005）；同一HK-LP添加濃度下，全魚粉和豆粕無顯著性差異（P>0.05）。當HK-LP添加107時，全魚粉組和豆粕組的大菱鲆甘油三酯含量都顯著低于不添加組；同一飼料組，大菱鲆甘油三酯水平隨HK-LP添加濃度增加而顯著降低（P<0.05）（見表2）。

2.2血清抗氧化力

雙因素結果分析顯示SOD極顯著地受到D和P兩個因素的影響（P<0.05），D和P兩因素對SOD的影響有交互作用（P<0.05）。在不添加HK-LP時，豆粕飼料SOD活性顯著低于魚粉飼料。添加HK-LP后，SOD活性顯著升高。在豆粕替代45%魚粉組，SOD活性隨HK-LP添加劑量的增加而顯著升高，而在全魚粉組三個濃度處理間無顯著性差異。S45R0這一處理SOD活力極顯著低于FM組，而添加HK-LP后，S45R7活性高于S0R0，說明含豆粕飼料添加HK-LP后SOD可以達到全魚粉的水平。CAT和MDA有著相反的變化趨勢，但是D、P兩因素沒有交互作用（P>0.05）。在對MDA影響上，飼料占主要因素，在不考慮P因素時，含豆粕飼料顯著提高了MDA含量（P<0.05）；在同一飼料組，MDA在HK-LP三個處理間沒有顯著性差異。CAT活力值在14.06～21.95之間，各處理組間均沒有顯著性差異（P>0.05，見表3）。表3攝食各處理組飼料大菱鲆的免疫酶活性的影響

飼料號

3討論

血清指標是反應魚類在遭遇營養(yǎng)和環(huán)境狀況改變時生理應激反應和綜合健康狀況的重要指標[22]。谷草轉氨酶（AST）和谷丙轉氨酶（ALT）是廣泛存在于動物線粒體中的重要氨基酸轉移酶，在機體蛋白質(zhì)代謝中起著重要的作用[23]。通常作為衡量肝臟功能的指標，其分泌到血液里含量的多少取決于肝臟細胞受損傷的程度[24]。機體在正常狀態(tài)下AST和ALT存在細胞內(nèi)部，由于細胞膜的屏蔽作用不容易逸出，血液中AST和ALT活性極低，但魚體肝臟受到損傷后擴散于血液中，血液中AST和ALT活性會升高。豆粕替代45%魚粉蛋白時AST和ALT都升高，但是當大菱鲆飼喂含HK-LP飼料后，AST和ALT活性均有不同程度的降低，尤其是喂食含豆粕飼料組，添加HK-LP與不添加HK-LP相比，AST有顯著性降低，表明乳酸菌能夠在一定程度上對肝臟起到保護作用，這與朱學芝等[25]（2007）在凡納濱對蝦上取得的結果一致。血清中膽固醇和甘油三酯含量的變化情況是反映機體脂質(zhì)代謝功能正常與否的主要指標。含豆粕飼料組大菱鲆血清的膽固醇與全魚粉組相比降低。當植物蛋白源替代飼料中魚粉后，虹鱒[26]和舌齒鱸（Dicentrarchuslabrax）[27]血漿中的膽固醇也呈現(xiàn)降低的趨勢。研究表明，植物產(chǎn)物會降低陸生動物體內(nèi)的膽固醇含量，主要是由植物產(chǎn)物中的類雌激素異黃酮所致[28]。陳京華[29]（2006）報道，使用豆粕替代魚粉蛋白后在替代的基礎上添加不同梯度的膽固醇飼喂牙鲆，結果表明豆粕替代魚粉后導致生長和血漿膽固醇濃度顯著下降，但補充1%的膽固醇顯著提高其生長和血漿膽固醇濃度，且與魚粉組無顯著差異。HK-LP組血清中甘油三酯減少，Mahmoud[30]也得出相似結論，認為魚類飼料添加某一濃度的HK-LP會保持魚類血清低濃度膽固醇和甘油三酯含量。外源乳酸菌可能是通過調(diào)控機體的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-Co A）還原酶及膽固醇7α-水解酶（CYP7A1）的合成和表達、降低膽固醇的重吸收等方式來降低機體膽固醇含量的[31]，也有體外試驗結果表明乳酸菌菌體細胞通過吸收、共沉淀、酶解轉化等途徑降低介質(zhì)中膽固醇的含量，具體機制需要進一步驗證[32]。血清總蛋白（TP）是反映肝臟合成蛋白質(zhì)能力的重要指標，該指標下降通常表明動物機體處于應激狀態(tài)[33]。虹鱒飼喂益生菌飼料試驗中也得到類似結論[13-14]。酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（ALP）通常作為刺參免疫指標，Yang 等[34]（2015）在海參上的研究，當加熱滅活的植物乳酸菌L-137在飼料中添加005 g時，體液中ACP和AKP活性顯著提升。ALP參與消化外來蛋白、脂肪和糖類。Cheng[35]（1989）指出酸性磷酸酶是一種典型的溶酶體酶，在免疫反應中能夠殺死和消化病原微生物，而堿性磷酸酶是一種多功能的酶，水解磷酸單酯基底，在堿性環(huán)境中擔當磷酸變位酶[36]。Xing等[37]（2002）研究櫛孔扇貝試驗中ALP活力高的試驗處理組，免疫也強大。本試驗含豆粕飼料沒有對ALP產(chǎn)生顯著性影響，但是在添加HK-LP后，ALP活性產(chǎn)生顯著性升高，表明HK-LP提高了大菱鲆免疫能力。Panigrahi等[13]（ 2010）指出血脂成分是重要的能源儲備，受到益生菌添加量的影響。

在正常情況下，動物機體內(nèi)會不斷產(chǎn)生自由基和內(nèi)源性抗自由基的活性物質(zhì)，自由基的生成與機體抗氧化防御系統(tǒng)之間處于一種良好的動態(tài)平衡中。魚類抗氧化指標與魚體免疫系統(tǒng)息息相關。SOD和CAT是生物機體內(nèi)重要的抗氧化酶，發(fā)揮著活性氧化劑清除劑的作用，在清除超氧自由基、過氧化氫和過氧化物以及阻止或減少羥基自由基形成等方面發(fā)揮重要作用。MDA是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成的脂質(zhì)過氧化物，其高低可以間接反應機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。在本研究中，含豆粕的飼料飼喂大菱鲆后，SOD活性降低相對的MDA含量升高，說明豆粕替代45%魚粉蛋白會降低魚類抗氧化能力。類似地，楊嚴鷗等[38]（2006）研究發(fā)現(xiàn)豆粕替代魚粉蛋白，黃顙魚SOD和溶菌酶活力顯著性降低，即免疫力顯著降低， 而且豆粕添加量越大，免疫力就越低。張錦繡等[39]（2003）也發(fā)現(xiàn)豆粕能使建鯉的腸道發(fā)生病變，使建鯉的免疫力下降。這可能也是由于飼料豆粕中的抗營養(yǎng)因子及氨基酸的不平衡等因素， 降低了魚類對飼料的消化、吸收， 而魚體在得不到良好的營養(yǎng)條件時免疫力會下降。本研究在飼料中添加合適濃度HK-LP后，發(fā)現(xiàn)含豆粕飼料組抗氧化指標能夠達到全魚粉水平，無顯著性差異，說明HK-LP作為免疫刺激劑，提高了大菱鲆幼魚的抗氧化能力。滅活菌的益生作用已經(jīng)在很多試驗中得到證實。Salinas等[40]（2008）研究指出加熱滅活的德式乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌可以提高金頭鯛的補體活性、血清過氧化物酶活性和吞噬作用。相似，Irianto和Austin[41]（2002）也表示滅活菌可以刺激虹鱒的非特異性免疫。本研究結果表明HK-LP可以通過提高大菱鲆幼魚的免疫力，從而提高其對豆粕蛋白的耐受力。滅活菌的免疫調(diào)節(jié)能力可能是由于某一微生物成分的存在，比如多糖莢膜、肽聚糖和磷脂壁酸，都能夠有效地刺激免疫系統(tǒng)。益生菌或者某一組成部分刺激魚類免疫系統(tǒng)的機制還不是很明確。Dawood等[30]（2015）在真鯛飼料中添加加熱滅活的植物乳酸桿菌和β-葡聚糖，確定了兩因素在真鯛生長、消化和非特異性免疫方面有交互作用。很多學者研究過益生菌和益生元之間的協(xié)同作用。加熱滅活的糞腸球菌和甘露寡糖配合使用增加了魚類體表粘液分泌量，抵御環(huán)境污染和應激源[12]。益生元本質(zhì)是一種不能被動物腸道自然消化的碳水化合物，通常與益生菌一起使用，通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)和刺激免疫系統(tǒng)來促進生物長期健康生長。

目前尚沒有明確將滅活細菌歸于益生菌、免疫增強劑抑或口服疫苗的某一類別。然而使用滅活的細菌作為飼料添加劑對水產(chǎn)養(yǎng)殖的益處亟待深入研究。

4結論

綜合分析，豆粕替代45%魚粉蛋白會降低大菱鲆幼魚的抗氧化能力，損害大菱鲆幼魚的肝臟，但是添加HK-LP能在一定程度上改善大菱鲆幼魚的免疫力，降低谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性，對肝臟有一定保護作用，從而提高大菱鲆對豆粕蛋白的耐受力。

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