李軍亮， 吳登龍， 黃盛松， 卞崔冬， 袁 濤， 桂亞平

(同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院泌尿外科，上海 200065)

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·基礎(chǔ)研究·

miRNA-29a調(diào)控H3K4甲基化在前列腺癌病理機理中的作用

李軍亮， 吳登龍， 黃盛松， 卞崔冬， 袁 濤， 桂亞平

(同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院泌尿外科，上海 200065)

目的 探討在前列腺癌中miR-29a與H3K4特異性去甲基化酶—KDM5B之間的關(guān)系，驗證miR-29a通過調(diào)控KDM5B的表達(dá)來抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。方法 將miR-29a模擬物(miR-29a mimic)片段和含野生型KDM5B基因3′-非翻譯區(qū)的熒光素酶報告載體(KDM5B-wt)共轉(zhuǎn)染至前列腺癌PC3和Lncap細(xì)胞后，進(jìn)行熒光素酶活性檢測。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-29a mimics轉(zhuǎn)染入人前列腺癌PC3和Lncap細(xì)胞中，MTT實驗檢測細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡；Real-Time PCR和Western印跡法檢測KDM5B表達(dá)水平。結(jié)果 轉(zhuǎn)染miR-29a mimics后，KDM5B的表達(dá)被明顯抑制 (P<0.01)，蛋白表達(dá)水平也明顯低于NC組。與NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-29a mimics組細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.01)，細(xì)胞生長被阻滯在S/G2期，細(xì)胞凋亡率較NC組增加(P<0.01)。結(jié)論 miR-29a可以通過調(diào)控H3K4特異性去甲基化酶-KDM5B的表達(dá)而抑制前列腺癌PC3和Lncap細(xì)胞的增殖。miR-29a有希望成為診斷和治療前列腺癌新的分子標(biāo)記和靶點。

前列腺腫瘤； miRNA-29a； KDM5B基因； 去甲基化酶

前列腺癌( prostate cancer， PCa)是威脅男性健康的常見腫瘤之一。微小RNA(microRNA，miRNA， miR) 目前已經(jīng)成為腫瘤研究的熱點，最近越來越多的證據(jù)表明miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的形成、惡性增殖和轉(zhuǎn)移等有關(guān)[1]，其主要作用是在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，降解mRNA或阻礙其翻譯[2]。研究表明，miR-29a 在前列腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，并且抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[3]。研究發(fā)現(xiàn)，KDM5B是組蛋白H3第四位賴氨酸(H3K4)的特異性去甲基化酶, KDM5B的過表達(dá)可以使得H3K4甲基化水平下降，但不影響其他組蛋白賴氨酸甲基化狀態(tài)；KDM5B在前列腺癌組織中高表達(dá)[4]。通過在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，KDM5B是miR-29a 調(diào)控的一個靶基因。本研究擬從分子水平探討miR-29a如何調(diào)控KDM5B，改變H3K4甲基化狀態(tài)，進(jìn)而調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

人前列腺癌PC3和LNCaP細(xì)胞購自中科院上海生化細(xì)胞研究所。RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國HyClone公司,胎牛血清購自Gibco公司。LipofectAMINE 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol購自美國Invitrogen公司；碘化丙啶(PI)、RNase、NP-40、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和MTS細(xì)胞生長增殖檢測試劑盒購自美國Sigma 公司；含野生型KDM5B基因3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region， 3′-UTR)的熒光素酶報告載體KDM5B-wt 和含突變型KDM5B基因3′-UTR 的熒光素酶報告載體KDM5B-mut 購自廣州銳博生物公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega 公司；蛋白質(zhì)提取試劑盒購自上海BestBio 貝博生物公司；增強型化學(xué)發(fā)光試劑和BCA 蛋白定量試劑購自美國Pierce 公司；兔抗人KDM5B單克隆抗體購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(二抗)購自武漢博士德生物工程有限公司；miR-29a模擬物(miR-269 mimic)、無關(guān)序列陰性對照(microRNA negative control， miR-NC)片段及靶向基因KDM5B的引物片段購自上海吉瑪生物公司，miR-29a mimic 片段序列為5′-GTGGAGGGTCCGAGGT-3′，miR-NC 片段序列為5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′；靶向基因KDM5B引物序列為5′-AGCAGACTGGCATCTGTAAGG-3′。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

PC3和LNCaP細(xì)胞生長于RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、100%飽和濕度、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈單層貼壁生長，細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90% 時進(jìn)行常規(guī)傳代。

1.3 熒光素酶活性檢測驗證miR-29a 是否與KDM5B 基因3′-UTR 結(jié)合

將對數(shù)生長期的PC3和LNCaP細(xì)胞收集起來，接種于6孔板(細(xì)胞密度為5×104個細(xì)胞/ml，2ml/孔細(xì)胞懸液)中，當(dāng)細(xì)胞融合度為60%～70% 時，按LipofectAMINE 2000說明書提供的方法分別將miR-29a mimic+KDM5Bwt、miR-NC+KDM5B-wt、miR-29a mimic+KDM5B-mut和miR-NC+KDM5B-mut共轉(zhuǎn)染至PC3和LNCaP細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h 后，收集各組細(xì)胞，按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書中提供的方法在單光子檢測儀(美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品)上進(jìn)行檢測，計算相對熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值(實驗重復(fù)3 次)。

1.4 miR-29a mimic轉(zhuǎn)染PC3和LNCaP細(xì)胞

轉(zhuǎn)染前1d收集融合度為80%的PC3和LNCaP細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個細(xì)胞/ml，將細(xì)胞以1× 105/孔接種于96孔板(100μl/孔細(xì)胞懸液)或6孔板中(2ml/孔細(xì)胞懸液)中，當(dāng)細(xì)胞在24h內(nèi)融合達(dá)60%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000，按試劑盒說明書提供的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實驗分3組： 陰性對照組(miR-NC組)；MOCK組(只加脂質(zhì)體)； miR-29a mimic組。在96 孔板中轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于后續(xù)的MTT法細(xì)胞增殖、周期、凋亡檢測，在6孔板中轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于后續(xù)的蛋白質(zhì)印跡法檢測。

1.5 轉(zhuǎn)染后KDM5B及蛋白質(zhì)水平檢測

TRIzol提取各實驗組轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲得各標(biāo)本cDNA。取2μl cDNA作為模板，加入18μl PCR反應(yīng)液[4μmol/L基因引物1μl，紅色熒光染料ROXDye(50×)0.4μl，dd H20 6.6μl，2×SYBR Premix Ex Taq 10μl]。在ABI 7900實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴增，反應(yīng)條件為 95℃ 預(yù)變性1min，95℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 45s，40個循環(huán)，72℃ 5min。計算各組間KDM5B mRNA表達(dá)水平的相對比值。

轉(zhuǎn)染48h后，抽提總蛋白，行蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。4℃條件下兔抗人KDM5B抗體(1∶1000)孵育過夜，熒光二抗(1∶1000)孵育后，用Odyseey數(shù)字顯像系統(tǒng)采集信號(以β-actin為內(nèi)參)。應(yīng)用Quantity One 軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白質(zhì)條帶的灰度值與內(nèi)參照GADPH 蛋白質(zhì)條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)水平(實驗重復(fù)3 次)。

1.6 MTT 法檢測miR-29a mimic轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞增殖的影響

收集本文1.4 節(jié)在96孔板中轉(zhuǎn)染miR-26a mimic、MOCK組(只加脂質(zhì)體)和miR-NC(對照組)0h,24h，48h，72h后的PC3和LNCaP細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞增殖活性的檢測，每孔加入20μl MTT，孵育4h，吸棄原液，加入150μl DMSO，震蕩10min，用酶標(biāo)儀檢測波長450nm處的吸光度(D450)，各組求均值，描繪總的生長曲線。細(xì)胞生長抑制率=(1-AmiR-29a mimic/AmiR-NC)×100%。每組設(shè)6個重復(fù)孔(實驗重復(fù)3次)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化

碘化丙錠(PI)可以與細(xì)胞內(nèi)RNA和DNA結(jié)合，利用RNA抑制劑將RNA消化，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測與DNA結(jié)合的PI的熒光強度，直接反映細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。通過流式細(xì)胞術(shù)PI染色法對細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測，可以將細(xì)胞周期各時相區(qū)分為G1/G0期，S期和G2/M期。本實驗取至少105個轉(zhuǎn)染24h后的各組細(xì)胞，離心吸棄上清液，用PBS洗滌2遍后，1×Binding buffer重懸細(xì)胞，300～500μl的標(biāo)記液標(biāo)記細(xì)胞。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞的凋亡率

將轉(zhuǎn)染48h后的PC-3細(xì)胞及LNCaP細(xì)胞收集起來，消化分離為1×105/ml的單細(xì)胞懸液，離心后用0.1mol/L的PBS液洗滌，共洗滌3次，700ml/L 乙醇固定30min，用10g/L Triton 100處理10min，10g/L的RNase 1ml處理10min，2.5g/L的碘化丙錠染色30min，采用美國Coulter公司EPLCS XL型流式細(xì)胞儀分析(實驗重復(fù)3次)，結(jié)果取平均值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件對各實驗的結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組間的比較采用t檢驗，組間兩兩比較采用SNK 法檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 KDM5B是miR-29a調(diào)控的靶基因

miR-29a mimic+KDM5Bwt、miR-NC+KDM5B-wt、miR-29a mimic+KDM5B-mut和miR-NC+KDM5B-mut共轉(zhuǎn)染至LNCaP 細(xì)胞后進(jìn)行熒光素酶活性檢測的結(jié)果(圖1A)顯示，miR-29a mimic+KDM5B-wt 共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的熒光素酶活性強度比miR-NC+KDM5B-wt 共轉(zhuǎn)染組下降了約51%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)；而miR-29a mimic+KDM5B-wt 共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的熒光素酶活性強度與miR-29a mimic+KDM5B-mut 共轉(zhuǎn)染組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這一結(jié)果說明，KDM5B 是miR-29a 調(diào)控的靶基因,見圖1。

qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果(圖1)顯示，miR-29 mimic 轉(zhuǎn)染48h 后，前列腺癌PC3和LNCaP 細(xì)胞中KDM5B 的表達(dá)水平低于miR-NC 轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。這一結(jié)果表明，高表達(dá)miR-29a 能抑制前列腺癌PC3和LNCaP 細(xì)胞KDM5B 的表達(dá)，進(jìn)一步證實KDM5B 是miR-29a 調(diào)控的靶基因。

圖1 熒光素酶報告載體(A、 B)、qRT-PCR(C、F)和蛋白質(zhì)印跡法(D、E、G、H)檢測miR-29a 調(diào)控KDM5B 的表達(dá)Fig.1 The expression of KDM5B regulated by miR-29a was detected by luciferase reporter vector (A, B), qRT-PCR (C, F)and Western blotting (D, E, G,H), respectively

2.2 miR-29a 過表達(dá)可抑制前列腺癌PC3和LNCaP細(xì)胞的增殖

MTT法檢測結(jié)果(圖2B)顯示，miR-29a mimic轉(zhuǎn)染組PC3和LNCaP細(xì)胞的增殖率明顯低于miR-NC轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；用PI標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)對LNCaP (C)和PC3 (D)細(xì)胞系進(jìn)行檢測，結(jié)果表明MiR-29a的過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞G1期減少，S期和G2期增加，即細(xì)胞周期改變主要是S期和G2期阻滯(P< 0.05)。

2.3 miR-29a 過表達(dá)可促進(jìn)前列腺癌PC3 和LNCaP 細(xì)胞的凋亡

用Annexin V-FITC 和PI 標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)對轉(zhuǎn)染后的PC3和LNCaP細(xì)胞系進(jìn)行檢測。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-29a 細(xì)胞組的細(xì)胞凋亡率較陰性對照組明顯增加(P< 0.05)。miR-29a誘導(dǎo)前列腺癌PC3細(xì)胞和LNCaP 的凋亡。

圖2 MTT法(A、B)和流式細(xì)胞術(shù)(C、D)分別檢測miR-29a mimic轉(zhuǎn)染后PC3和LNCaP細(xì)胞增殖率和細(xì)胞周期Fig.2 Cell proliferation and cell cycle in PC3 and LNCaP cells after transfection with miR-29a mimic detected by MTT assay (A, B) and flow cytometry (C,D),respectively

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分別檢測miR-29a mimic轉(zhuǎn)染后PC3 (B)和LNCaP (A)細(xì)胞的凋亡Fig.3 Cell apoptosis in PC3 and LNCaP cells after transfection with miR-29a mimic detected by flow cytometry(C,D),respectively

3 討 論

前列腺癌( prostate cancer， PCa) 是美國等西方發(fā)達(dá)國家男性最常見的惡性腫瘤性疾病[5]，同時也是男性癌癥致死的第二大因素[6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，大約有30%左右的前列腺癌患者一發(fā)現(xiàn)就是臨床進(jìn)展型前列腺癌，治療效果較差[7]；而且雄激素依賴型前列腺癌在抗雄激素治療18～24個月后大約有80%會轉(zhuǎn)變成雄激素非依賴型前列腺癌，目前沒有徹底治愈的方法[8]。

組蛋白甲基化修飾在基因活性調(diào)節(jié)中扮演著重要的角色，組蛋白甲基化的紊亂可能導(dǎo)致癌變的發(fā)生[9]。最新研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白H3第四位賴氨酸二甲基修飾(H3K4diMe)與低分級前列腺癌患者手術(shù)后預(yù)后有關(guān)[10]。KDM5B是H3K4特異性去甲基化酶，KDM5B的過表達(dá)可以使得H3K4甲基化水平下降，但不影響其他組蛋白賴氨酸甲基化狀態(tài)；且KDM5B在前列腺癌組織中高表達(dá)[4]。miR-29a位于7q32，在前列腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，且抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[3], 但在前列腺癌發(fā)病中miR-29a調(diào)控組蛋白去甲基化的分子機制仍不清楚。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)軟件查詢、熒光素酶報告基因活性檢測和蛋白質(zhì)印跡法等分子生物學(xué)技術(shù)證實，KDM5B是miR-29a 調(diào)控的靶基因，轉(zhuǎn)染miR-29a mimic可降低KDM5B的表達(dá)，并且抑制前列腺癌PC3 和LNCaP細(xì)胞的增殖，以及誘導(dǎo)前列腺癌PC3細(xì)胞和LNCaP 的凋亡。這一結(jié)果說明，MiR-29a通過抑制KDM5B表達(dá)，抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖及促進(jìn)凋亡，從而起抑癌基因作用。本研究初步揭示了miR-29a 對前列腺癌PC3 和LNCaP的抑制機制。最近則有文獻(xiàn)報道，miR-29a 可通過抑制laminin γ1 (LAMC1)的表達(dá)而抑制前列腺癌的生長和增殖[3]。因此，進(jìn)一步研究miR-29a 在前列腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機制，為針對以miR-29a 為作用靶點發(fā)現(xiàn)新的治療措施提供實驗和理論基礎(chǔ)，這無疑是十分必要的。

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miRNA-29a inhibits proliferation and induces apoptosis of prostate cancer cells by regulating H3K4 methylation

LIJun-liang,WUDeng-long,HUANGSheng-song,BIANCui-dong,YUANTao,GUIYa-ping

(Dept. of Urology, Tongji Hospital, Tongji University, Shanghai 200065, China)

Objective To investigate the effect of miRNA-29a on cell proliferation and apoptosis of prostate cancer cells and its mechanism. the—KDM5B in prostate cancer, verify miR-29a suppresses prostate cancer (PCa) cell proliferation and induces apoptosis via KDM5B protein regulation. Methods miR-29a mimic and luciferase reporter vector KDM5B-wt were co-transfected into prostate cancer PC3 and Lncap cells, and the luciferase activity was detected. The cell proliferation was examined by MTT assay, cell cycle and apoptosis was assessed by flow cytometry, the mRNA and protein expression levels of KDM5B, a specific demethylase of H3K4, were detected by real-time PCR and Western blotting, respectively. Results After transfection， the relative expression level of KDM5B in miR-29a mimic group was significantly reduced (P<0.01) as compared to that of NC group， and the protein level was also significantly decreased.Compared to NC group， the cell proliferation in miR-29a mimic group was significantly inhibited (P<0.01)， the cell cycle was arrested at S/G2 phase， and the cell apoptosis rate was increased (P<0.01). Conclusion miR-29a can suppress the cell proliferation by targeting KDM5B expression, a specific demethylase of H3K4, in prostate cancer PC3 and Lncap cells, which indicates that miR-29a might be used as a new molecular marker and target for diagnosis and treatment of prostate cancer.

prostate cancer； miRNA-29a； KDM5B gene； demethylase

10.16118/j.1008-0392.2016.06.002

2015-12-14

國家自然科學(xué)基金面上項目(81172426)；上海市教育委員會科研創(chuàng)新項目(12ZZ034)

李軍亮(1986—)，男，碩士.E-mail： lijunliang.1986@163.com

吳登龍.E-mail： wudenglong@163.com

R 737.25

A

1008-0392(2016)06-0006-06