李福霞, 胡維娜, 胡瓊波

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

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球孢白僵菌對(duì)亞洲玉米螟血細(xì)胞毒力和形態(tài)的影響

李福霞, 胡維娜, 胡瓊波

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

摘要：【目的】測(cè)定球孢白僵菌 Beauveria bassiana對(duì)亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis血細(xì)胞系SYSU-OfHe-C的影響，為促進(jìn)球孢白僵菌在防治亞洲玉米螟中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。【方法】采用MTT和CCK- 8法測(cè)定球孢白僵菌對(duì)亞洲玉米螟血細(xì)胞系SYSU-OfHe-C的毒力，通過(guò)光學(xué)顯微鏡與掃描電鏡觀察球孢白僵菌生長(zhǎng)及其對(duì)SYSU-OfHe-C細(xì)胞的影響?！窘Y(jié)果】球孢白僵菌分生孢子處理SYSU-OfHe-C細(xì)胞24 h后，MTT法的IC50值為2.8×105 mL-1，CCK- 8法的IC50值為1.4×105 mL-1。光學(xué)顯微鏡實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在SYSU-OfHe-C細(xì)胞對(duì)數(shù)期接種球孢白僵菌濃度為3.5×104 mL-1時(shí)，球孢白僵菌具有明顯競(jìng)爭(zhēng)力，未發(fā)現(xiàn)囊胞化與吞噬等細(xì)胞免疫現(xiàn)象；處理10 h后，球孢白僵菌分生孢子開(kāi)始萌發(fā)長(zhǎng)出菌絲，而SYSU-OfHe-C細(xì)胞減少且開(kāi)始變形；處理24 h，球孢白僵菌幾乎長(zhǎng)滿整個(gè)視野；SYSU-OfHe-C細(xì)胞從近似圓形變長(zhǎng)或者變?yōu)椴灰?guī)則形狀，出現(xiàn)聚集、破碎、胞內(nèi)空泡、瘤狀突起，以及被白僵菌菌絲穿透等現(xiàn)象?！窘Y(jié)論】球孢白僵菌可改變亞洲玉米螟血細(xì)胞系SYSU-OfHe-C的細(xì)胞形態(tài)，但不能使其發(fā)生細(xì)胞免疫現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞：球孢白僵菌； 亞洲玉米螟； 血細(xì)胞； SYSU-OfHe-C； MTT法； CCK- 8法

球孢白僵菌Beauveria bassiana是目前研究較深入、應(yīng)用廣泛的一種昆蟲(chóng)病原真菌，其致病性強(qiáng)、殺蟲(chóng)范圍廣，在多種害蟲(chóng)的防治中取得了顯著的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益[1]。我國(guó)曾大規(guī)模地應(yīng)用球孢白僵菌防治馬尾松毛蟲(chóng)Dendrolimus punctatus Walker，并取得了巨大的成功[2-3]。球孢白僵菌也廣泛應(yīng)用于防治亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis，特別是我國(guó)東北地區(qū)利用白僵菌防治越冬代玉米螟成為玉米螟生物防治的重要方法[4-5]。

球孢白僵菌侵染寄主昆蟲(chóng)一般要經(jīng)歷分生孢子的附著、萌發(fā)與穿透表皮，菌絲在血腔內(nèi)生長(zhǎng)、產(chǎn)生毒素、致死寄主、入侵所有器官繼而穿出表皮，產(chǎn)生新一代分生孢子、繼續(xù)擴(kuò)散流行等階段。球孢白僵菌的致病機(jī)理不像化學(xué)農(nóng)藥那樣依靠自身毒力殺死害蟲(chóng)，而是通過(guò)吸收寄主體內(nèi)水分和養(yǎng)分滿足自身菌絲生長(zhǎng)，導(dǎo)致寄主體內(nèi)生理代謝紊亂或代謝發(fā)生障礙而死亡。關(guān)于寄主昆蟲(chóng)對(duì)球孢白僵菌的免疫作用已有一些研究，大臘螟Galleria mellonalla幼蟲(chóng)感染球孢白僵菌后在最佳條件和熱激條件下產(chǎn)生不同的體液免疫能力[6]；接種球孢白僵菌分生孢子對(duì)桑天牛Apriona germari幼蟲(chóng)血細(xì)胞數(shù)量有顯著的影響[7]。對(duì)亞洲玉米螟幼蟲(chóng)注射不同劑量球孢白僵菌芽生孢子后，其血細(xì)胞總數(shù)發(fā)生變化，活體與離體血細(xì)胞均對(duì)芽生孢子產(chǎn)生包囊作用，但是在活體條件下血細(xì)胞粘附在芽生孢子表面形成包囊，而在離體條件下包囊形成的速度較慢，其致密程度不如活體狀態(tài)，表明亞洲玉米螟對(duì)球孢白僵菌芽生孢子具有細(xì)胞防御能力[8]。膜翅目寄生蜂腰帶長(zhǎng)體繭蜂Macrocentrus cingulum是亞洲玉米螟的重要天敵，腰帶長(zhǎng)體繭蜂的卵不會(huì)被亞洲玉米螟血細(xì)胞囊胞化，因而可以在其體內(nèi)完成發(fā)育，這一現(xiàn)象說(shuō)明寄主昆蟲(chóng)與寄生物具有復(fù)雜的免疫與抗免疫關(guān)系[9-10]。

亞洲玉米螟血細(xì)胞系SYSU-OfHe-C由中山大學(xué)胡建博士創(chuàng)建，可連續(xù)繼代培養(yǎng)[11]。本研究將考察球孢白僵菌對(duì)亞洲玉米螟血細(xì)胞SYSU-OfHe-C的毒性及其形態(tài)的影響，進(jìn)一步研究亞洲玉米螟幼蟲(chóng)與球孢白僵菌的免疫互作關(guān)系，促進(jìn)利用球孢白僵菌防治亞洲玉米螟生物防治技術(shù)的發(fā)展。

1材料與方法

1.1材料

亞洲玉米螟幼蟲(chóng)血細(xì)胞系SYSU-OfHe-C由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院胡建博士饋贈(zèng)。球孢白僵菌BbTS01菌株是華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從西藏日喀則市白朗縣土壤中分離獲得。

EX-CELL420培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma公司)；胎牛血清(Gibco公司)； MTT(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；CCK- 8(日本同仁公司)；二甲基亞砜DMSO(美國(guó)Sigma公司)；吐溫80(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。

酶標(biāo)儀(iMark，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；倒置顯微鏡(MF52型，廣州市明美光電技術(shù)有限公司)； 96孔板(美國(guó)Corning Incorporated 公司)，血球計(jì)數(shù)板(上海求精生化試劑儀器有限公司)。

1.2方法

亞洲玉米螟幼蟲(chóng)血細(xì)胞系SYSU-OfHe-C采用EX-CELL420培養(yǎng)基添加φ為10%的胎牛血清，27 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔3～4 d傳代1次，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于試驗(yàn)。球孢白僵菌BbTS01菌株取斜面菌種接種于PDA平板上培養(yǎng)約2周，收集分生孢子。取分生孢子100 mg，用2 g·L-1的吐溫水1 mL配成懸浮液，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為107mL-1備用。

1.2.1球孢白僵菌對(duì)血細(xì)胞系SYSU-OfHe-C細(xì)胞的毒力測(cè)定1) MTT法：96孔板每孔加入90 μL受試細(xì)胞懸浮液，靜置培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞濃度為1×105mL-1時(shí)，分別滴加10 μL球孢白僵菌分生孢子懸浮液，使球孢白僵菌分生孢子終濃度分別達(dá)到3.5×106、3.5×105、3.5×104、3.5×103mL-1，以2 g·L-1吐溫水為對(duì)照，以不加細(xì)胞的完全培養(yǎng)基為本底，每個(gè)處理重復(fù)4次。在27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入50 μL的1×MTT，27 ℃培養(yǎng)4 h，吸出上清液(懸浮細(xì)胞用此法時(shí)經(jīng)1 000 r·min-1離心后去除上清液)，每孔加入150 mL DMSO使甲臜溶解，搖勻；酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的D490 nm。2) CCK- 8法：細(xì)胞培養(yǎng)與處理方法同上述MTT法，接種球孢白僵菌分生孢子并培養(yǎng)24 h后，向每孔加入10 μL CCK- 8溶液，注意不形成氣泡，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定D450 nm。

1.2.2球孢白僵菌對(duì)血細(xì)胞系SYSU-OfHe-C細(xì)胞形態(tài)的影響96孔板每孔加入90 μL受試細(xì)胞懸浮液，靜置24 h，接種球孢白僵菌分生孢子懸浮液使其終濃度為3.5×104mL-1，倒置顯微鏡下監(jiān)測(cè)球孢白僵菌與血細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，每隔30 min拍照記錄。取上述接種球孢白僵菌后培養(yǎng)24 h的亞洲玉米螟血細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡與掃描電子顯微鏡下觀察其形態(tài)變化，并拍照記錄。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS軟件分析細(xì)胞死亡率，改良寇氏法[12]計(jì)算IC50值。

細(xì)胞死亡率=[1-(D處理-D本底)/(D對(duì)照- D本底)]×100%，

IC50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)]，式中，Xm為處理最大濃度的對(duì)數(shù)值；i為各濃度倍比濃度的對(duì)數(shù)值；ΣP為各組死亡率之和；0.5為經(jīng)驗(yàn)常數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1球孢白僵菌對(duì)血細(xì)胞系SYSU-OfHe-C細(xì)胞的毒力測(cè)定

球孢白僵菌對(duì)SYSU-OfHe-C細(xì)胞的毒力測(cè)定結(jié)

果見(jiàn)圖1，不同濃度的球孢白僵菌分生孢子懸浮液處理24 h后，SYSU-OfHe-C細(xì)胞的死亡率不同，隨著球孢白僵菌分生孢子懸浮液濃度的增大，SYSU-OfHe-C細(xì)胞的死亡率增加，總體上看，CCK- 8法與MTT法的結(jié)果相差不大，但前者測(cè)得的SYSU-OfHe-C細(xì)胞死亡率更高一點(diǎn)，當(dāng)球孢白僵菌分生孢子懸浮液濃度為3.5×106mL-1，CCK- 8法測(cè)得的SYSU-OfHe-C細(xì)胞死亡率達(dá)77.3%，MTT法為66.4%；球孢白僵菌分生孢子懸浮液濃度為3.5×103mL-1，CCK- 8法與MTT法的死亡率分別為15.2%和15.6%。CCK- 8法與MTT法測(cè)得球孢白僵菌對(duì)SYSU-OfHe-C細(xì)胞的毒力回歸方程見(jiàn)表1，從表1可知MTT法測(cè)得球孢白僵菌分生孢子對(duì)SYSU-OfHe-C細(xì)胞的IC50(2.8×105mL-1)稍高于CCK- 8法的IC50(1.4×105mL-1)。

圖1球孢白僵菌處理24 h后SYSU-OfHe-C細(xì)胞的死亡率

Fig.1The mortality rate in SYSU-Of He-C cells at 24 hours after treatment of Beauveria bassiana

表1球孢白僵菌對(duì)SYSU-OfHe-C細(xì)胞的毒力回歸方程和IC50值

Tab.1The toxicity regression equation and IC50value of Beauveria bassiana against SYSU-OfHe-C cells

方法毒性回歸方程1)2PIC50/(105mL-1)95%置信區(qū)間/(105mL-1)MTTy=0.01x+32.65411.0290.0402.80.682～1.111CCK-8y=0.01x+35.9994.8860.0871.40.835～1.228

1)x為濃度的對(duì)數(shù)值，y為死亡率。

2.2球孢白僵菌對(duì)血細(xì)胞系SYSU-OfHe-C細(xì)胞形態(tài)的影響

在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在接種球孢白僵菌分生孢子后，大約10 h分生孢子萌發(fā)長(zhǎng)出菌絲，此后

菌絲不斷伸長(zhǎng)，亞洲玉米螟血細(xì)胞開(kāi)始移動(dòng)、數(shù)量變少且形態(tài)改變，至24 h左右，球孢白僵菌菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)視野，未見(jiàn)囊胞化與吞噬作用(圖2)。

a：SYSU-OfHe-C細(xì)胞；b：球孢白僵菌菌絲；標(biāo)尺為100 μm。

接種球孢白僵菌分生孢子24 h后，SYSU-OfHe-C細(xì)胞部分從近似圓形變長(zhǎng)或者變?yōu)椴灰?guī)則形狀，似乎還原成漿血細(xì)胞和類絳色細(xì)胞的原始形狀，但未見(jiàn)吞噬與囊胞化等細(xì)胞免疫現(xiàn)象發(fā)生。另外，也發(fā)現(xiàn)少數(shù)SYSU-OfHe-C細(xì)胞聚集、破碎、細(xì)胞減少，以及出現(xiàn)空泡和瘤狀突起等現(xiàn)象(圖3)。在掃描電鏡下還觀察到球孢白僵菌菌絲穿透SYSU-OfHe-C細(xì)胞的現(xiàn)象(圖4)。

CK：對(duì)照； A1～A4表示球孢白僵菌處理濃度分別為3.5×103、3.5×104、3.5×105、3.5×106mL-1; ag：細(xì)胞聚集，ex：細(xì)胞膨脹，va：空泡，db：細(xì)胞破碎，str：瘤狀突起; 標(biāo)尺為100 μm。

圖3球孢白僵菌對(duì)SYSU-OfHe-C細(xì)胞形態(tài)的影響

Fig 3Effects of Beauveria bassiana on the morphology of SYSU-OfHe-C cells

A：對(duì)照； B：處理； a、b分別表示對(duì)照組和處理組SYSU-OfHe-C細(xì)胞；c：球孢白僵菌菌絲。

圖4掃描電鏡下的球孢白僵菌菌絲與SYSU-OfHe-C細(xì)胞的相互作用

Fig 4The interaction between Beauveria bassiana mycelia and SYSU-OfHe-C cells under scanning electron microscopy

3討論與結(jié)論

本研究運(yùn)用MTT和CCK- 8法測(cè)定了球孢白僵菌對(duì)SYSU-OfHe-C細(xì)胞的毒力，結(jié)果有一定差異，可能原因是：使用MTT法檢測(cè)時(shí)，需要使用裂解液溶解甲臜晶體沉淀，可能遇到顆粒不完全溶解、吸取上清的操作中帶走部分細(xì)胞等問(wèn)題，導(dǎo)致MTT法的結(jié)果容易出現(xiàn)細(xì)胞死亡率比實(shí)際情況偏低的情況；而CCK- 8是一種綜合指標(biāo)較好的細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑，對(duì)細(xì)胞的毒性相當(dāng)?shù)?，其檢測(cè)原理和檢測(cè)條件與MTT法略有差異。CCK- 8法產(chǎn)生的甲臜是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟，減少一定的誤差，使試驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定，盡管當(dāng)有還原物質(zhì)存在時(shí)會(huì)影響CCK- 8的測(cè)定，但CCK- 8法一般比MTT法更加靈敏、穩(wěn)定，而且重復(fù)性較好。

昆蟲(chóng)細(xì)胞免疫反應(yīng)是由血細(xì)胞介導(dǎo)的，主要依賴血細(xì)胞對(duì)外來(lái)異物的吞噬、集結(jié)和包囊[13]。包囊反應(yīng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞免疫反應(yīng)中占有很重要的位置，對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞免疫反應(yīng)的研究必定要進(jìn)行囊胞化分析。本試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)亞洲玉米螟細(xì)胞系SYSU-OfHe-C對(duì)球孢白僵菌的囊胞化與吞噬作用等細(xì)胞免疫現(xiàn)象，可能原因之一是SYSU-OfHe-C本身特性決定的，其缺乏血漿的某些成份，影響了其囊胞化效率[11]；也與球孢白僵菌本身的特性有關(guān)，球孢白僵菌是一種通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)策略使寄主昆蟲(chóng)生病的蟲(chóng)生真菌，通過(guò)增加入侵量和快速分裂或生長(zhǎng)來(lái)逃避寄主昆蟲(chóng)的免疫防御[14]；也可能與血細(xì)胞的密度有關(guān)[15]，自然情況下，亞洲玉米螟體內(nèi)血細(xì)胞密度約為1.0×107～4.0×107mL-1[9]，本研究采用細(xì)胞密度為1.0×105mL-1，低于亞洲玉米螟體內(nèi)血細(xì)胞密度，有可能造成SYSU-OfHe-C細(xì)胞囊胞化作用降低。

球孢白僵菌等微生物制劑的廣泛應(yīng)用是農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要方向，亞洲玉米螟是我國(guó)重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，生物因子在控制亞洲玉米螟種群數(shù)量方面起著十分重要的作用[16]。通過(guò)研究球孢白僵菌對(duì)亞洲玉米螟血細(xì)胞系SYSU-OfHe-C的毒力作用和對(duì)其細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)的影響，為進(jìn)一步深入研究亞洲玉米螟幼蟲(chóng)與球孢白僵菌的免疫互作奠定基礎(chǔ)，有利于促進(jìn)球孢白僵菌對(duì)亞洲玉米螟的生物防治。

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【責(zé)任編輯霍歡】

Effects of Beauveria bassiana on virulence and cellular morphology of hemocytes of Ostrinia furnacalis

LI Fuxia, HU Weina, HU Qiongbo

(College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Abstract：【Objective】 To test the effect of Beauveria bassiana on SYSU-OfHe-C, a cell line from hemocytes of Ostrinia furnacalis. To provide a theory basis for application of B.bassiana in the prevention and treatment of O. furnacalis.【Method】 MTT and CCK- 8 were employed to test the virulence of B. bassiana on SYSU-OfHe-C. Optical microscope and scanning electron microscope were used to observe the growth of B. bassiana and its influence on the morphology of SYSU-OfHe-C cells. 【Result】The IC50values of B.bassiana against SYSU-OfHe-C cells at 24 hours after treatment were recorded as 2.8×105and 1.4×105 mL-1respectively by MTT and CCK- 8. Furthermore, under real-time monitoring with optical microscope, encapsulization and phagocytosis were not found and B. bassiana was highly competitive when the conidia of B. bassiana were inoculated in the culture of SYSU-OfHe-C cells at logarithmic stage reaching a final concentration of 3.5×104 mL-1for B. bassiana. B. bassiana started to germinate at 10 hours after treatment, and meanwhile, SYSU-OfHe-C cells started to reduce in number and change in morphology. At 24 hours after treatment, B. bassiana grew the entire visual field. The nearly round SYSU-OfHe-C cells had elongated or turned into irregular shape. Aggregation, fragmentation, cavitation, protuberance and penetration of SYSU-OfHe-C cells caused by B.bassiana mycelia were observed.【Conclusion】B.bassiana can change cellular morphology of hemocytes of O. furnacalis, but cannot induce its immune responses.

Key words：Beauveria bassiana; Ostrinia furnacalis; hemocyte; SYSU-OfHe-C; MTT method; CCK- 8 method

收稿日期：2015- 11- 10優(yōu)先出版時(shí)間：2016- 06- 01

作者簡(jiǎn)介：李福霞(1991─)，女，碩士研究生，E-mail：953239652@qq.com；通信作者：胡瓊波(1963─)，男，副教授，博士，E-mail：qbscau@scau.edu.cn

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)(林業(yè))科研專項(xiàng)(201304408)

中圖分類號(hào)：S476.12

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001- 411X(2016)04- 0032- 06

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20160601.1630.034.html

李福霞, 胡維娜, 胡瓊波.球孢白僵菌對(duì)亞洲玉米螟血細(xì)胞毒力和形態(tài)的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,37(4):32- 37.