劉超，劉乙蒙，欒治東，任麗莉，孟智超，肖建英

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 發(fā)育生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001；2. 遼寧醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 神經(jīng)生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001；3. 遼寧醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧 錦州 121001；4. 遼寧醫(yī)學(xué)院教務(wù)處，遼寧 錦州 121001)

酵母雙雜交技術(shù)篩選與蛋白激酶Wee1相互作用的蛋白

劉超1，劉乙蒙1，欒治東1，任麗莉2，孟智超3，肖建英4Δ

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 發(fā)育生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001；2. 遼寧醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 神經(jīng)生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001；3. 遼寧醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧 錦州 121001；4. 遼寧醫(yī)學(xué)院教務(wù)處，遼寧 錦州 121001)

目的 應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選出與Wee1蛋白激酶相互作用的候選分子，為進(jìn)一步研究Wee1 的分子功能提供理論基礎(chǔ)。方法 利用分子克隆的方法重組酵母雙雜交質(zhì)粒 pGBKT7-Wee1，并驗(yàn)證其在酵母中的毒性、自激活能力和表達(dá)。利用酵母雙雜交技術(shù)從人卵巢cDNA文庫中篩選出與Wee1蛋白相互作用的蛋白，并在酵母中重新驗(yàn)證其相互作用。結(jié)果 成功構(gòu)建 pGBKT7-Wee1誘餌質(zhì)粒，驗(yàn)證了其無毒性及自激活能力，且可以在酵母中表達(dá)，可進(jìn)一步進(jìn)行酵母雙雜交的篩選工作。結(jié)論 利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出與Wee1相互作用的候選分子30個，為揭示蛋白激酶Wee1可能通過與其他蛋白相互作用進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程。

Wee1；酵母雙雜交；蛋白互作

成熟促進(jìn)因子(mature promoting factor，MPF)是真核生物細(xì)胞周期進(jìn)程中一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，在減數(shù)分裂和有絲分裂細(xì)胞周期調(diào)控中起著重要作用，可作為細(xì)胞周期調(diào)控中整合信號的中心樞紐[1-2]。從結(jié)構(gòu)上看，MPF是一種復(fù)合物，由細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，Cdk1)即細(xì)胞分裂周期2(cell division cycle 2，Cdc2)與細(xì)胞周期蛋白B(cyclinB)共同組成，其活性的調(diào)控主要是通過調(diào)節(jié)Cdc2上的3個磷酸化位點(diǎn)(Thr161、Thr14和Tyr15)的磷酸化狀態(tài)來實(shí)現(xiàn)，而Wee1激酶家族和Cdc25磷酸酶主要是通過磷酸化/去磷酸化Thr14和Tyr15 進(jìn)而影響 MPF的活性[3]。

在高等動物中，Wee1蛋白激酶家族有3種相關(guān)基因，Wee1、Wee2和Pkmyt1[4-5]。在裂殖酵母中，Wee1催化Tyr15位點(diǎn)發(fā)生磷酸化[6]，而人Wee1基因編碼的一段酪氨酸特殊序列也可以磷酸化Cdc2的Tyr15位點(diǎn)[7]。由此可見，Wee1主要通過使Tyr15位點(diǎn)磷酸化而負(fù)性調(diào)控Cdc2的活性，且Wee1 主要定位于細(xì)胞核中[8]。而Wee1家族的另一個成員，Pkmyt1 則結(jié)合MPF復(fù)合體，定位于細(xì)胞質(zhì)，并可以通過磷酸化Thr l4和Tyr l5來調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程[9]。因此，在哺乳動物中，Wee1和Pkmyt1對有絲分裂負(fù)調(diào)控的作用已經(jīng)很明確。隨著研究的進(jìn)行，人們對Wee1家族的另一成員Wee2的認(rèn)識也更加深入。Wee2主要是存在于卵母細(xì)胞中[10]，與Wee1相似的是其在細(xì)胞核中可以通過使Tyr15位點(diǎn)磷酸化而負(fù)性調(diào)控Cdc2的活性[11]，可能不同的是，在某些組織中Wee2的活性要高于Wee1[12]。

Wee1蛋白激酶家族一個重要高度保守的調(diào)控方式是通過蛋白質(zhì)相互作用[13]，基于Wee1家族在細(xì)胞周期進(jìn)程中的重要作用和Wee1家族保守的調(diào)控方式，尋找與Wee1家族的相互作用蛋白顯得尤為重要。為了進(jìn)一步闡明Wee1蛋白激酶的活性調(diào)控分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室以Wee1為誘餌，利用酵母雙雜交系統(tǒng)從人卵巢cDNA文庫篩選出與蛋白激酶Wee1家族相互作用的分子，為進(jìn)一步研究Wee1 的分子功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 質(zhì)粒pGBKT7(遼寧醫(yī)學(xué)院欒治東博士惠贈)；RNA PCR(AMV)Ver3.0試劑盒，SMARTScribe Reverse Transcriptase，E.coliCompetent Cell DH5α，Nde I，SalⅠ(Takara公司，日本)；Mate&PlateTM Library-Human Ovary、Easy Yeast Plasmid Isolation Kit、Yeast Media Set 2 Plus和Yeast Transformation Kit(Clontch公司，日本)；c-myc標(biāo)簽抗體(Santa Cruz公司，美國)、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Western細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)公司)。

恒溫?fù)u床QYC-200型(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，電泳儀和電泳槽(Bio-Rad公司，美國)，BOX-600全自動凝膠成像系統(tǒng)(UVP公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 pGBKT7-Wee1 誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建：根據(jù)小鼠Wee1(Genebank ID: NM_009516.3)序列，設(shè)計特異性PCR引物，在上游引物和下游引物分別增加限制性內(nèi)切酶Nde I(-CAT ATG-)和Sal I(-GTC GAC-)位點(diǎn)。PCR反應(yīng)的引物序列如下：上游引物：5′-CGCCATATGAGCTTCCTGAGCCGACAGCAGCC-3′；下游引物：5′- GCGTCGACTCAGTATATAGTAAGGCTGACAG-3′。以小鼠腦組織cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增出目的條帶，PCR反應(yīng)體系50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃、7 min，94 ℃、45 s，55 ℃、30 s，72 ℃、3 min，35個循環(huán)，72 ℃、10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，進(jìn)行膠回收和純化。將膠回收產(chǎn)物與載體 pGBKT7用SalⅠ和NdeI雙酶切，37 ℃中3 h，將雙酶切的目的片段與載體連接，于16 ℃ 連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，于 37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16～18 h，觀察平板菌落生長情況。挑取單個菌落接種于2 mL含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中；37 ℃培養(yǎng)過夜，離心，棄上清，提取pGBKT7-Wee1質(zhì)粒，可-20 ℃中保存?zhèn)溆谩⑸鲜龅玫劫|(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將經(jīng)過酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送往北京鼎國公司進(jìn)行測序，并通過NCBI網(wǎng)站的Blast功能對測序結(jié)果進(jìn)行比對，將測序結(jié)果完全正確的重組質(zhì)粒擴(kuò)大培養(yǎng)并保存，以備后用。

1.2.2 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Wee1 轉(zhuǎn)化酵母的毒性、自激活檢測：復(fù)蘇酵母菌Y2H Gold，并制備酵母感受態(tài)。分別將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Wee1和pGBKT7空載轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，分別取100 μL，涂于SD/-Trp固體培養(yǎng)板上，30 ℃倒置孵育3～5 d，觀察2個平板酵母菌菌落生長的形態(tài)、數(shù)量、大小、顏色等差異，進(jìn)行誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Wee1的毒性檢測。將上述已轉(zhuǎn)化好的pGBKT7-Wee1菌液取100 μL，分別涂于 SD/-Trp(SDO)、SD/-Trp/X-α-Gal(SDO/X)和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA plates(SDO/X/A)固體培養(yǎng)板上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察各個平板酵母菌菌落生長的形態(tài)、數(shù)量、大小、顏色，進(jìn)行誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Wee1的自激活檢測。

1.2.3 Western blot檢測誘餌蛋白 Wee1在酵母細(xì)胞中的表達(dá)：從已轉(zhuǎn)化 pGBKT7-Wee1和pGBKT7 的 SD/-Trp固體培養(yǎng)板上挑取一個新鮮的直徑為 2～3 mm的酵母菌落接種于5 mLSD/-Trp液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床中30 ℃，250 rpm，過夜培養(yǎng)12～16 h使OD600達(dá)到0.4～0.6；擴(kuò)大再培養(yǎng)，4 ℃，2000 g離心5 min，棄上清；沉淀置于-80 ℃冰箱中，以備后用；將預(yù)熱好的裂解液迅速加入沉淀中使其融化，每7.5總OD600值加80 μL glass beads；70 ℃水浴鍋中加熱10 min；4 ℃，14000 rpm，離心5 min；將上清轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管；100 ℃水浴煮樣5 min，可保存于-80 ℃冰箱中；配制10%分離膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，用含0.5% BSA的TBST將c-myc抗體按1:1000稀釋，4 ℃孵育過夜；將PVDF膜取出后，用TBST清洗3次，將PVDF膜放入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1:3000稀釋)，室溫?fù)u床上孵育2 h；洗膜后，用ECL發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光成像。

1.2.4 含誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Wee1 的酵母菌與人卵巢 cDNA 文庫融合 從含有pGBKT7-Wee1的SD/-Trp 培養(yǎng)平皿上挑取直徑為2～3 mm的酵母菌落接種于1mLSD/-Trp液體培養(yǎng)基中，劇烈震蕩渦旋；將上述液體全部轉(zhuǎn)入50 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，于搖床中30 ℃，震蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.8；1000 g室溫離心5 min，棄上清；加入4 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基，吹打混勻，要確保細(xì)胞計數(shù)達(dá)到108以上；從 -80 ℃ 冰箱取出之前凍存的人卵巢cDNA文庫，水浴鍋中溶解；將4 mL pGBKT7-Wee1靶菌株和1 mL人卵巢cDNA文庫混合在一起，加入到2 L滅菌的錐形瓶中；錐形瓶中再加入45 mL 2×YPDA(含有50 μg/mL kana)液體培養(yǎng)基；用1 mL 2×YPDA(含有50 μg/mL kana)液體培養(yǎng)基清洗裝有文庫的離心管 2次，并合并到2 L錐形瓶中；在恒溫?fù)u床中 30 ℃，40 rpm，低轉(zhuǎn)速培養(yǎng)20～24 h；20 h后，取2 μL 雜交液稀釋10倍(18 μL SD/-Trp 液體培養(yǎng)基)滴于載玻片上，40×顯微鏡下查看雜交結(jié)果，若見相融合細(xì)胞則可停止培養(yǎng)，未見則一直培養(yǎng)至出現(xiàn)融合細(xì)胞；室溫下1000g，離心10 min，棄上清；用25 mL 0.5×YPDA(含有50 μg/mL kana)液體培養(yǎng)基清洗錐形瓶2次，合到一起并重懸細(xì)胞沉淀；室溫下1000 g，離心10 min，棄上清；用10 mL 0.5×YPDA(含有50 μg/mL kana)液體培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀；取1 mL雜交產(chǎn)物稀釋成4個濃度：10-1、10-2、10-3、10-4，各濃度吸取100 μL 分別涂于鋪板于SD/-Trp、SD/-leu、SD/-leu/-Trp 固體培養(yǎng)平板上；將剩余雜交產(chǎn)物涂于150 mm SD/-Trp/-Leu 平板上，每板 200 μL；30 ℃ 倒置孵育 3～5 d；用高壓過的牙簽挑取 DDO/X/A 盤子上的所有藍(lán)色克隆接種到SD/-Trp/-Leu/-His/Ade /X-α-gal(QDO/X/A)盤子上；30 ℃ 倒置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d；3～5 d后標(biāo)記 QDO/X/A 高度缺陷培養(yǎng)基上的藍(lán)色克隆，將培養(yǎng)板用封口膜封好4 ℃保存。

1.2.5 酵母質(zhì)粒的提取和陽性克隆的分析：將上一步得到藍(lán)色克隆接種于 3 mL SD/-Leu 液體培養(yǎng)基中，30 ℃，250 rpm，過夜培養(yǎng) 16～24 h；收集過夜培養(yǎng)的酵母菌液于滅菌的EP管中，5000g離心1 min，棄上清；進(jìn)行酵母質(zhì)粒提取。利用酵母的F-T7(5′-CTATTCGATGATGAAGATACCCCAAACCC-3′)，R-3′AD(5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′)為引物按以下反應(yīng)體系和條件進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性7 min；94 ℃ 30 s；55 ℃ 45 s；72 ℃ 3 min；30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取陽性克隆質(zhì)粒送北京鼎國公司進(jìn)行測序，并通過NCBI網(wǎng)站的Blast功能對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，歸納，整理數(shù)據(jù)。

1.2.6 在酵母體內(nèi)重新驗(yàn)證候選分子與 Wee1 的相互作用：誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Wee1和pGADT7-X 共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，同時共轉(zhuǎn)化pGBKT7-53 和pGADT7-T 作為陽性對照；pGBKT7-Lam 和pGADT7-T 作為陰性對照；pGBKT7 空載和 pGADT7-X 作為對照組；具體操作過程按照1.2.4進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 pGBKT7-Wee1誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 以小鼠腦組織 cDNA 為模版進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增出長 1941 bp 的 Wee1 基因(見圖1A)，純化后分別用NdeI /SalI 雙酶切，與經(jīng)同樣酶切的 pGBKT7 載體連接，篩選陽性克隆，對陽性克隆進(jìn)行NdeI /SalI 酶切鑒定(見圖1B)及 DNA 測序分析，經(jīng)Blast比對之后完全正確。

圖1 Wee1瓊脂糖凝膠電泳分析A：Wee1的PCR產(chǎn)物電泳圖；B：pGBKT7-Wee1 雙酶切后電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of Wee1A:PCR products of Wee1 generated 1941 bp fragments; B:Double enzyme digestion results of pGBKT7-Wee1 with Nde I and Sal I

2.2 誘餌質(zhì)粒 pGBKT7-Wee1 對酵母細(xì)胞毒性及自激活能力檢測

2.2.1 誘餌質(zhì)粒 pGBKT7-Wee1 對酵母細(xì)胞的自激活能力檢測：將誘餌質(zhì)粒 pGBKT7-Wee1(見圖2A)和空載體 pGBKT7(見圖2B)分別轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)中，菌液接種于SD/-Trp(SDO)平板上培養(yǎng)，結(jié)果顯示2平板上的克隆都均勻生長，且大小、形態(tài)、數(shù)量、顏色相一致，說明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Wee1 對酵母菌無毒性作用。

圖2 誘餌質(zhì)粒 pGBKT7-Wee1 的毒性檢測A：pGBKT7-Wee1質(zhì)粒在SD/-Trp 盤子生長；B：空載體pGBKT7在 SD/-Trp盤子生長Fig.2 The bait plasmid pGBKT7- Wee1 on the toxicity of yeastA:pGBKT7-Wee1on SD/-Trp plates;B:pGBKT7on SD/-Trp plates

2.2.2 誘餌質(zhì)粒 pGBKT7-Wee1：對酵母細(xì)胞的自激活能力檢測：將誘餌質(zhì)粒 pGBKT7-Wee1轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)中，將菌液分別接種于SD/-Trp(SDO)、SD/-Trp/X-a-Gal(SDO/X)、SD/-Trp/X-α-Gal/AbA(SDO/X/A)平板上培養(yǎng)，結(jié)果顯示，SD/-Trp平板(見圖3A)和SD/-Trp/X-α-Gal(見圖3B)平板上為有克隆生長而 SD/-Trp/X-α-Gal/AbA (見圖3C)缺陷培養(yǎng)基上無克隆生長，說明誘餌質(zhì)粒 pGBKT7-Wee1 在酵母中無自激活能力。

圖3 誘餌質(zhì)粒 pGBKT7-Wee1的自激活能力檢測A：質(zhì)粒pGBKT7-Wee1在SD/-Trp盤子生長；B：pGBKT7-Wee1在SD/-Trp/X-α-Gal 盤子生長；C：pGBKT7-Wee1在SD/-Trp/X-a-Gal/AbA盤子生長Fig.3 The bait plasmid pGBKT7- Wee1 on the self-activation of yeastA:pGBKT7-Wee1 on SD/-Trp plates;B:pGBKT7-Wee1 on SD/-Trp/X-α-Gal plates;C:pGBKT7-Wee1在SD/-Trp/X-a-Gal/AbA plates

2.3 誘餌蛋白Wee1在酵母細(xì)胞中的表達(dá) pGBKT7和pGBKT7-Wee1分別轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，裂解細(xì)胞提取酵母蛋白，用 Western blot 檢測 Wee1在酵母細(xì)胞中表達(dá)情況。結(jié)果表明Wee1 融合蛋白在酵母中可以很好的表達(dá)(見圖4)。

圖4 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Wee1在酵母中的表達(dá)Fig.4 Protein expression of bait plasmid pGBKT7- Wee1 in yeast

2.4 PCR驗(yàn)證陽性克隆 將含有誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Wee1的酵母菌與人卵巢cDNA文庫相融合后進(jìn)行大規(guī)模篩選上挑取QDO/X/A板上的藍(lán)色克隆，提取酵母質(zhì)粒，以酵母 F-T7，R-3’AD 為引物進(jìn)行 PCR 鑒定(見圖5)。將經(jīng)過鑒定有陽性克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提質(zhì)粒送測序。共挑選出陽性克隆 242個，抽取質(zhì)粒經(jīng) PCR 鑒定和測序，得到不重復(fù)且有意義的陽性克隆30個。

圖5 PCR鑒定陽性克隆質(zhì)粒M：Marker；1-16：PCR產(chǎn)物Fig. 5 Identification of positive clones by PCRM: Marker；1-16:PCR products

2.5 酵母體內(nèi)驗(yàn)證 Wee1 與候選分子的相互作用 為了進(jìn)一步驗(yàn)證文庫篩選的結(jié)果，本研究將pGBKT7-Wee1和pGBKT7-jun B重新共轉(zhuǎn)化酵母Y2H 感受態(tài)細(xì)胞，按4個濃度梯度 10-1、10-2、10-3、10-4，涂于 SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-GAL/AbA 平板 30 ℃ 倒置溫育3～5 d后，生長出藍(lán)色菌落。這表明了候選分子和Wee1在酵母中存在相互作用(見圖6)。

圖6 候選分子與 Wee1 在酵母中存在相互作用A：pGBKT7-53和pGADT7-T共轉(zhuǎn)染；B：pGBKT7-Lam和pGADT7-T共轉(zhuǎn)染；C：pGBKT7 和 pGADT7-X共轉(zhuǎn)染；D：pGBKT7-Wee1B 和 pGADT7-X共轉(zhuǎn)染Fig.6 Candidate molecules interact with Wee1 in yeast A:Co-transformation of pGBKT7-53+pGADT7-T; B:Co-transformation ofpGBKT7-Lam+pGADT7-T; C:Co-transformation of pGBKT7 and pGADT7-X;D:Co-transformation of pGBKT7-Wee1B and pGADT7-X

3 討論

近年來，關(guān)于Wee1的研究較多，也取得了不少的進(jìn)展[14-15]，但關(guān)于Wee1蛋白的磷酸化位點(diǎn)和關(guān)鍵有功能的元件，與其他細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子之間的關(guān)系，尤其是與14-3-3蛋白作用的具體機(jī)制、磷酸化的Wee1如何被調(diào)控去磷酸化以及Wee1如何實(shí)現(xiàn)核內(nèi)外穿梭平衡來調(diào)控MPF活性等問題，仍是進(jìn)一步需要探討的問題。為進(jìn)一步研究 Wee1 在細(xì)胞周期調(diào)控過程中的重要作用，本實(shí)驗(yàn)以Wee1為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交的方法從人卵巢cDNA 文庫中篩選與Wee1相互作用的候選蛋白。首先本研究將Wee1構(gòu)建到pGBKT7載體上，并證實(shí)了誘餌質(zhì)粒 pGBKT7-Wee1在酵母中無毒性且無自激活能力，可用于酵母雙雜交的篩選，進(jìn)而通過Western blot檢測到Wee1融合蛋白在酵母中有很好的表達(dá)，可以進(jìn)行下一步的篩選工作。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)，大規(guī)模篩選人卵巢cDNA 文庫，得到陽性克隆 30 個。測序后經(jīng)Blast分析比對，同源分析表明編碼全長目標(biāo)蛋白的cDNA 片段。大致分成下列幾類：①蛋白激酶類；②轉(zhuǎn)錄因子類；③凋亡相關(guān)蛋白類；④核糖體蛋白類；⑤未知蛋白；⑥其他類等。

綜上所述，本研究通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出與Wee1互相作用的蛋白30個，并用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行分類分析，因此，深入了解Wee1調(diào)節(jié)的生物學(xué)和其催化活性的生物化學(xué)特性將有助于開發(fā)Wee1的特異抑制劑，并希望有助于癌癥治療的進(jìn)展。

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(編校：王冬梅)

Screening of proteins interacting with protein kinase Wee1 by yeast two hybrid system

LIU Chao1, LIU Yi-meng1, LUAN Zhi-dong1, REN Li-li2, MENG Zhi-chao3, XIAO Jian-ying4Δ

(1.Department of Developmental Biology, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China; 2.Department of Neurobiology, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China; 3. Department of Experimental Teaching Center of Basic Medicine, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China; 4. Department of Teaching Affairs, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo screen out the candidate molecules interacting with Wee1 protein kinase by yeast two hybrid technique, and to provide theoretical basis for further study of the molecular function of Wee1.MethodsThe yeast two hybrid plasmid pGBKT7-Wee1 was cloned by molecular cloning method, and its toxicity, self-activation ability and expression in yeast were verified. Screening of proteins interacting with Wee1 from human ovary cDNA library and the interaction between them was verified by yeast two hybrid technique.ResultsThe bait plasmid pGBKT7-Wee1 was successfully constructed, and the plasmid had no toxicity and self-activation ability, and the bait plasmid could be expressed in yeast.Conclusion30 candidate molecules interacting with Wee1 are screened by yeast two hybrid system, which reveales that protein kinase Wee1 might regulate cell cycle progression by interacting with other proteins.

Wee1; two-hybrid system; protein-protein interaction

國家自然科學(xué)基金資助課題(81270698；31371173；81401199)，遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃項(xiàng)目(2015020697)

劉超，女，博士，副教授，研究方向：生殖生理,E-mail:jzyxyshlc3333@sina.com；肖建英，通信作者，女，博士，教授，研究方向：分子生殖和分子腫瘤，E-mail: xiaojianying@lnmu.edu.cn。

Q132.7

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.03.06