賈雪燕　李　舒　張　紅　杜曉泉

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽712046)

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5%TNBS與乙醇不同劑量配伍優(yōu)化大鼠UC模型的探索*

賈雪燕李舒張紅杜曉泉△

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽712046)

摘要目的：對比5%TNBS與不同濃度無水乙醇聯(lián)合液誘導(dǎo)大鼠UC模型的差異，優(yōu)化大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的造模方法。方法：40只雌性SD大鼠， 隨機(jī)分為8組，包括1個(gè)正常組和7個(gè)模型組(n=5)。濃度分別為：模型1組：(5%TNBS 0.25mL+無水乙醇0.25mL)；模型2組：(5%TNBS 0.2mL+無水乙醇0.2mL)；模型3組：(5%TNBS 0.07mL+無水乙醇0.15mL+純水0.8mL)；模型4組：( 5%TNBS0.3mL+無水乙醇0.2mL)；模型5組：(5%TNBS0.07mL+無水乙醇0.12mL+純水0.11mL)；模型6組：( 5%TNBS 0.1mL+80%乙醇0.1mL)；模型7組：( 5%TNBS0.09mL+無水乙醇0.06mL)。采用不同配比的混合液對各組大鼠分別進(jìn)行灌腸，觀察各組大鼠的死亡率以及體重的變化。造模10d后取距離肛門8cm處結(jié)腸組織進(jìn)行病理切片。結(jié)果：與正常組比較，模型組各組均出現(xiàn)黑便癥狀以及結(jié)腸潰瘍的病理改變，模型1、2、3組10的死亡率為100%，模型4組20%，模型5組為80%，模型6組為60%，造模7組沒有死亡現(xiàn)象。結(jié)論：采用5%TNBS聯(lián)合乙醇復(fù)制大鼠UC模型的最佳配置比例為：5%TNBS 0.09mL和無水乙醇0.06mL。

主題詞結(jié)腸炎，潰瘍性/中西醫(yī)結(jié)合療法動(dòng)物實(shí)驗(yàn)大鼠

潰瘍性結(jié)腸炎是一種發(fā)病機(jī)制尚未闡明的慢性、復(fù)發(fā)性的炎癥性腸病。據(jù)流行病學(xué)顯示近20年UC的發(fā)病率與人們的生活水平呈正相關(guān)且逐年增高，發(fā)病年齡范圍也越來越廣泛。據(jù)統(tǒng)計(jì)，亞洲的發(fā)病率為1.0/10萬～2.0/10萬，患病率為4.0/10萬～44.3/10萬，中國UC患病率為11.6/10萬，因此，規(guī)范UC的治療，降低UC的發(fā)病率，是當(dāng)前醫(yī)務(wù)工作者的重要任務(wù)[1]。大量臨床病歷研究顯示，中醫(yī)藥治療UC有顯著療效，在一定程度上大大降低了UC的患病率和復(fù)發(fā)率。在中醫(yī)藥治療UC的機(jī)理和療效研究中，動(dòng)物模型的建立是研究結(jié)果真實(shí)準(zhǔn)確的基礎(chǔ)。目前，關(guān)于UC的造模動(dòng)物有SD大鼠、Wistar大鼠、C57小鼠等[2]。造模方法主要有化學(xué)誘導(dǎo)模型、免疫法等，如2，4，6—三硝基苯磺酸(TNBS)法、乙酸灌腸、DSS葡聚糖硫酸鈉等[3]。其中通過TNBS造模來探討UC患者活動(dòng)期癥狀，研究藥物對潰瘍性結(jié)腸炎患者的治療作用及機(jī)制，為治療潰瘍性結(jié)腸炎奠定了理論基礎(chǔ)[4]。對于TNBS造模時(shí)造模劑的配置劑量，有報(bào)道研究，不同劑量的TNBS，對造出潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的影響不同[5]，也認(rèn)識到把握好麻醉及TNBS/乙醇混合液的劑量是降低死亡率，建立持續(xù)而穩(wěn)定的大鼠慢性潰瘍性結(jié)腸炎模型的關(guān)鍵[6]。迄今關(guān)于TNBS/乙醇混合液的最佳配置劑量研究未見報(bào)道。本論文通過采用5%TNBS誘導(dǎo)大鼠腸損傷制作潰瘍性結(jié)腸炎的模型實(shí)驗(yàn)，觀察大鼠病情變化及腸粘膜的病理變化，旨在尋找5%TNBS與乙醇的最佳造模配置比。

1材料與方法

1.1研究動(dòng)物清潔級SD雄性大鼠40只(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號：SYXK(陜)2012-003)，體重(180-220g)。

1.2實(shí)驗(yàn)器材5%TNBS(美國sigma公司，批號： P2297)，無水乙醇(西安化學(xué)試劑廠，批號：130618)，水合氯醛(上海山浦化學(xué)有限公司)，生理鹽水(石家莊四藥有限公司)，一次性使用兒童導(dǎo)尿硅膠管(揚(yáng)州市桂龍醫(yī)療器械有限公司)，固體石蠟(德州默霖消毒科技有限公司)，一次性1mL注射器，PBS，10%甲醛(成都市科龍化工有限公司)。

1.3造模方法除正常組外，模型組參考Karaca[7-8]制備方法采用TNBS誘導(dǎo)的動(dòng)物模型，將40只SD雌性大鼠隨機(jī)分成七組，造模組35只，具體濃度和劑量參照表1，正常組5只，僅灌注0.5mL生理鹽水。造模前大鼠須禁食不禁水12h，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3mL/100g)，在固體石蠟潤滑下，用改良后的一次性兒童硅膠導(dǎo)尿管，導(dǎo)入距離肛門約8cm的結(jié)腸，導(dǎo)入造模液0.15mL。注意：導(dǎo)入造模液時(shí)取頭低尾高位，并倒置40s，保證造模液與結(jié)腸充分接觸，然后將大鼠頭低尾高30度體位放置于墊料中5min。造模完后，調(diào)整室溫至27℃～30℃，直至大鼠自然蘇醒。

表1　UC造模濃度和劑量

1.4觀察大鼠體重、進(jìn)食、糞便情況、記錄死亡數(shù)量分別于大鼠造模前及處死前稱量大鼠體重，在造模完成后觀察大鼠的體重，進(jìn)食情況以及有無粘液膿血便的狀況。記錄各組動(dòng)物死亡的情況，計(jì)算第10天的死亡率。

1.5大鼠結(jié)腸組織病理切片HE染色觀察將大鼠麻醉，取距離肛門8cm處結(jié)腸組織，經(jīng)PBS清洗后迅速將其投入包埋框，并用10%甲醛固定，浸泡12h，然后進(jìn)行石蠟組織包埋，切片(厚度為3um)，并HE染色，觀察大鼠結(jié)腸的變化。

2結(jié)果

2.1一般情況實(shí)驗(yàn)組大鼠造模后從第一天開始都有活動(dòng)減少，食欲下降，精神萎靡，便血等癥狀。兩天后出現(xiàn)黑便，大便形狀成扁橢圓形，持續(xù)至取材當(dāng)天。正常對照組食欲正常，大便無明顯變化，造模后進(jìn)食水稍多。

2.2大鼠造模前后體重的比較造模前大鼠平均體重為236.6g，造模后大鼠平均體重為274.7g，比較造模前后的體重有所增加，經(jīng)T檢驗(yàn)比較，有顯著性差異，P<0.0001。

2.3各組大鼠死亡率的變化七組造模大鼠造模后陸續(xù)開始有死亡現(xiàn)象，10天之內(nèi)，如表2所示，模型1、2、3組10的死亡率為100%，模型4組20%，模型5組為80%，模型6組為60%，造模7組沒有死亡現(xiàn)象。解剖死亡大鼠，發(fā)現(xiàn)大部分造模組大鼠死亡原因?yàn)槟c梗阻所致。見表2。

表2　造模后大鼠死亡率的比較

2.4各組結(jié)腸組織的病理學(xué)變化正常組大鼠結(jié)腸表面光滑血管清晰，內(nèi)壁絨毛整齊規(guī)律，可見杯狀細(xì)胞，無出血和潰瘍面。造模1組腸道內(nèi)壁表面絨毛消失，大量炎性細(xì)胞浸潤，潰瘍深入到肌層。造模2組可見腸道內(nèi)壁絨毛刷狀緣大面積消失，有大量的空泡細(xì)胞，黏膜及粘膜下層變薄。造模3組清晰可見黏膜和黏膜下層大量炎性細(xì)胞浸潤，刷狀緣部分消失，部分可見。造模4組可見整齊刷狀緣，有少量小潰瘍，基底部有少量出血。造模5組明顯可見有出血，少量潰瘍，刷狀緣整齊可見空泡細(xì)胞。造模6組腸黏膜隱窩處有小膿腫形成，黏膜及黏膜下層可見中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，繼而有廣泛潰瘍形成。潰瘍底部有時(shí)可見急性血管炎，血管壁成纖維素樣壞死。造模7組可見明顯小潰瘍面，腸粘膜隱窩處有小膿腫，黏膜下層可見大量炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

3討論

潰瘍性結(jié)腸炎確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確，需要加強(qiáng)研究。關(guān)于潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制和實(shí)驗(yàn)治療學(xué)的研究主要依賴于動(dòng)物模型，成功復(fù)制潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型是開展UC發(fā)病機(jī)制和中西藥防治UC 的關(guān)鍵。常見的動(dòng)物模型有C57小鼠，SD大鼠等。TNBS灌腸所復(fù)制的動(dòng)物模型與人類UC病變特點(diǎn)相似，是研究藥物治療效用與機(jī)制較好的模型，但是，目前使用TNBS誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的濃度以及與無水乙醇的比例存在多種方案，尚無確切數(shù)值，造模的成功率不夠穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，造模劑的濃度是制約模型成功的關(guān)鍵因素，因此，急需探索TNBS與無水乙醇聯(lián)合的合適比例，優(yōu)化大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的造模方法。本實(shí)驗(yàn)摸索出采用TNBS結(jié)合乙醇造模的最佳實(shí)驗(yàn)條件：濃度比例為5%TNBS 0.09mL與無水乙醇0.06mL，實(shí)驗(yàn)室溫度必須保持在27℃～30℃以保證大鼠的體溫，麻醉劑量為10%水合氯醛0.3mL/100g。此種造模比例最為經(jīng)濟(jì)有效，周期短，方法簡單，是研究潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制和有關(guān)中醫(yī)藥療效觀察的理想模型。

圖1　七組造模大鼠與正常組大鼠結(jié)腸組織HE染色的比較(×100)

綜合我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示 采用5%TNBS結(jié)合乙醇造UC大鼠模型的最佳配置比例為：5%TNBS 0.09mL和無水乙醇0.06mL。這種比例造出的潰瘍性結(jié)腸炎模型不僅有黑便、腹瀉、精神倦怠等潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀，而且死亡率小，病理組織切片也符合潰瘍性結(jié)腸炎的表現(xiàn)，值得應(yīng)用。

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(收稿2016-001-12；修回2016-02-23)

5% TNBS coordinate with different doses of ethanol to optimize the model of UC in rats

ShaanxiUniversity of Chinese Medicine(Xianyang712046)

Jia XueyanLi ShuZhang Honget al

ABSTRACTObjective： To compare the difference of 5% TNBS joint different concentrations of ethanol to induce UC model in rats，and optimize the methods inducing UC. Methods:40 female SD rats were randomly divided into eight groups， including a control group and seven model group (n=5). The ethanol concentrations were shown as following： Model 1 group： (5% TNBS 0.25mL+ ethanol 0.25mL); model 2 groups： (5% TNBS 0.2mL + ethanol 0.2mL); Model 3 groups： (5% TNBS 0.07mL + dry Ethanol 0.15mL + water 0.8mL); Model 4 group with 0.3mL 5% TNBS and 0.2mL ethanol， model 5 groups with 0.07mL 5% TNBS and pure water and ethanol 0.11mL 0.12mL， model six groups with 0.1mL5 % TNBS and 80% ethanol 0.1mL， model 7 groups with 0.09mL5% TNBS and ethanol 0.06mL. A mixture of different proportions of each group were lavaged. After modeling 10d， mortality and changes in body weight of the rats were observed. and colon tissue at 8 cm from the anus were taken for morphology. Results： Compared with normal group， melena symptoms and pathological changes of the colon ulcers were found in each model group.l Mortality were 100% in No. 1，2，3 groups ，20% in No. 4 group， 80% in No. 5 group and 60% in No. 6 group， but no mortality in No. 7 groups. Conclusion： The optimal allocation of TNBS and ethanol for rat model of UC is 5% TNBS 0.09mL and ethanol 0.06mL.

KEY WORDSColitis，Ulcerative/Traditional Chinese medicine therapyAnimal ExperimentationRats

通訊作者△

【中圖分類號】R574.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7369.2016.07.081

*陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (2013K12-01-20)