趙秀玲，李坤

(黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山 245021)

?

黑果枸杞精油成分提取及體外抗氧化性研究

趙秀玲，李坤

(黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山 245021)

摘 要：以黑果枸杞為材料，采用水蒸氣蒸餾法提取黑果枸杞精油，利用GC–MS法對精油成分進(jìn)行分離和鑒定，并以抗壞血酸(V–C)為陽性對照，以DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基的清除率為評價指標(biāo)，研究黑果枸杞精油的體外抗氧化性。結(jié)果表明：從黑果枸杞精油中共鑒定分離出了38種化合物，主要成分為亞油酸、棕櫚酸、反油酸，2，3–二氫苯并呋喃、亞油酸甲酯、2–甲氧基–4–乙烯基苯酚，以有機(jī)酸類和酯類為主(占85.696%)；抗氧化性研究結(jié)果顯示，黑果枸杞精油對DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基清除的半抑制濃度(IC50)分別為0.002 21、0.007 68、0.000 09 μg/μL。

關(guān) 鍵 詞：黑果枸杞；精油；氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用；化學(xué)成分；抗氧化性

黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)為茄科枸杞屬植物，主要分布于中國、巴基斯坦、印度等國家。中國主要分布于西北地區(qū)，如寧夏、新疆、西藏、青海、內(nèi)蒙、甘肅等地。黑果枸杞味甘、性平、清心熱，果實(shí)在傳統(tǒng)中藥中被用來治療心臟病，月經(jīng)異常及停經(jīng)等[1]；民間用于滋補(bǔ)強(qiáng)壯，明目及降壓等[2]。果實(shí)中含有精油[3]、多糖、色素和黃酮等活性成分，還含有氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和微量元素[4]。植物精油具有防腐、抗氧化、抑菌、殺蟲等多種活性。不同植物的精油效用及應(yīng)用前景被人們逐一挖掘[5]。目前，國內(nèi)外對黑果枸杞的研究大多是多糖、黃酮、花色苷等化學(xué)成分的提取研究，但對其精油的化學(xué)組成及其抗氧化性的研究鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)以黑果枸杞為試材，采用水蒸氣蒸餾法提取精油，并測定了黑果枸杞精油對DPPH自由基、ABTS自由基和羥自由基3種自由的清除率，旨在為黑果枸杞中精油的高效利用和開發(fā)新型抗氧化類保健食品提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

供試黑果枸杞產(chǎn)自青海格爾木諾木洪。

1,1–二苯基–2–苦肼基(DPPH)，上海士鋒科技有限公司產(chǎn)品；2,2–聯(lián)氮基–雙–(3–乙基苯并噻唑啉–6–磺酸)–二氨鹽(ABTS)，上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司產(chǎn)品；V–C(抗壞血酸)、無水乙醚、FeSO4溶液、H2O2、水楊酸、過硫酸鉀、無水硫酸鈉等均為國產(chǎn)，分析純。

1.2儀器與設(shè)備

UV754N紫外可見光光度計(jì)，上海成光儀器廠產(chǎn)品；Agilent HP7890–5975C氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司產(chǎn)品；精油提取器，北京亞歐德鵬科技有限公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1黑果枸杞精油的提取

黑果枸杞粉碎，過孔徑為0.175 mm的篩，備用。

準(zhǔn)確稱取黑果枸杞粉末20 g，置于500 mL精油提取器中，加入300 mL蒸餾水，加熱至微沸，收集精油6 h，往收集好的精油中加入一定量的無水硫酸鈉，靜置過夜，過濾，濾渣用無水乙醚洗滌，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去精油中的乙醚，得黑果枸杞脫水精油，備用。

1.3.2黑果枸杞精油成分檢測

該礦區(qū)內(nèi)無大的河流,溝谷發(fā)育,溝溪水枯季流量小或干枯,雨后山間溝溪水流量較大，受降雨控制明顯。暴雨后有山洪發(fā)生。只有下山河從礦區(qū)南部流過，本次調(diào)查測流量為最大86 L/s。

采用Agilent HP7890–5975C氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀對提取的精油進(jìn)行主成分檢測。色譜柱為HP–5MS，石英毛細(xì)管(0.25 μm，30 m×0.25 mm)。升溫程序?yàn)椋?0 ℃保持3 min，4 ℃/min升溫到160℃，保持3 min，6 ℃/min升到290 ℃，保持10 min。載氣為高純氦氣，體積流量為1.0 mL/min，分流比為30∶1，進(jìn)樣口溫度為280 ℃，進(jìn)樣量為0.5 μL。質(zhì)譜條件為電子轟擊(EI)離子源，電子能量為70 eV，溶劑延遲2.2 min，掃描質(zhì)量數(shù)范圍(m/z )35～450。

1.3.3黑果枸杞精油抗氧化性的測定

1) DPPH自由基清除作用的測定。參照文獻(xiàn)[6]的方法并略作修改，具體操作如下：取一定量提取好的精油，用丙酮稀釋至體積分?jǐn)?shù)為20%；分別取稀釋好的精油20、40、60、80、100和120 μL置于6支試管，樣品體積少于120 μL的試管以丙酮補(bǔ)至120 μL，配制成樣品質(zhì)量濃度梯度分別為0.001 67、0.003 34、0.005 00、0.006 67、0.008 33、0.100 00μg/μL的溶液；分別加入2 mL濃度為60 μmol/mL的DPPH甲醇溶液，搖勻，在黑暗中靜置30 min，于517 nm處測定吸光度，記為A1，以甲醇為空白對照，在517 nm處測吸光度，記為A0，以V–C為陽性對照，DPPH自由基清除率(1－A1/A0)。上述試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

2) 羥基自由基的清除作用測定。參照文獻(xiàn)[7]的方法并略作修改，具體操作如下：分別取體積分?jǐn)?shù)為20%的丙酮精油溶液 20、40、60、80、100、120 μL置于6支試管，樣品體積少于120 μL的試管用丙酮補(bǔ)至120 μL，配制成樣品質(zhì)量濃度梯度分別為0.001 67、0.003 34、0.005 00、0.006 67、0.008 33、0.100 00 μg/μL的溶液，再往各試管分別加入9 mmol/L FeSO4，9 mmol/L 水楊酸–乙醇溶液2 mL，加入12 mmol/L H2O22 mL，混勻，于37 ℃反應(yīng)30 min；以去離子水調(diào)零，用分光光度計(jì)于510 nm處測定吸光度，記為A1；以去離子水代替雙氧水重復(fù)上述操作，測得精油樣品的分光光度值，記為A2；再以水代替精油，測得分光光度值，記為A0；以V–C為陽性對照，羥基自由基清除率(1－(A1－A2)/A0)。上述試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

3) ABTS自由基的清除作用測定。參照文獻(xiàn)[8]的方法：取7 mmol/L ABTS+溶液5 mL，加入140 mmol/L過硫酸鉀88 μL，混合，在室溫避光條件下反應(yīng)12～16 h，用無水乙醇稀釋成在734 nm波長下吸光度為0.7±0.02的溶液；取體積分?jǐn)?shù)為20%丙酮精油樣品溶液20、40、60、80、100、120 μL，配制成質(zhì)量濃度梯度分別為0.001 67、0.003 34、0.005 00、0.006 67、0.008 33、0.100 00 μg/μL的溶液；分別加入2 mL ABTS自由基溶液，6 min后測其吸光度，記為Ai；測定2 mL無水乙醇溶液與不同體積樣品的吸光度，記為Aj；測定2 mL ABTS自由基溶液分別與20、40、60、80、100、120 μL無水乙醇混合后的吸光度，記為A0；以V–C為陽性對照。ABTS自由基清除率((A0–Ai+Aj)/A0)。每個試樣重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)系統(tǒng)分析得到的總離子流圖，采用NIST08圖譜庫檢索，鑒定黑果枸杞精油的各種成分；利用峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析，計(jì)算各化學(xué)成分在精油中的相對含量。

2　結(jié)果與分析

2.1黑果枸杞精油GC–MS分析結(jié)果

黑果枸杞精油所得成分的GC–MS總離子流圖見圖1；成分分析結(jié)果見表1。從黑果枸杞精油中共分離出了72個色譜峰，鑒定出38種化合物，占精油總量的98.684%，包括有機(jī)酸類7種(77.16%)，酯類7種(8.536%)，雜環(huán)類3種(4.379%)，酚類5 種(3.688%)，醇類4種(3.172%)，醛類4種(1.211%)，烴類5種(0.368%)，酮類(0.126%)，醚1種(0.044%)。主要以有機(jī)酸類和酯類為主，雜環(huán)類、酚類、醇類、醛類、烴類、酮類和醚成分含量低。

在黑果枸杞精油已鑒定出的成分中，含量高于2.0%的成分有亞油酸(39.185%)，棕櫚酸(23.418%)，反油酸(12.153%)，2，3–二氫苯并呋喃(4.242%)，亞油酸甲酯(3.820%)，2–甲氧基–4–2乙烯基苯酚(3.271%)，(9z)–9，17–十八碳二烯醇(2.372%)。這7種主要成分占精油總量的88.462%，包括3種酸類、3種雜環(huán)類、1種酯類、1種酚類和1種醇類。

圖1　黑果枸杞精油的GC–MS總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile oils from Lycium ruthenicum

表1　黑果枸杞精油的GC–MS分析結(jié)果Table 1　Results on GC–MS analysis of volatile oils from Lycium ruthenicum

2.2 黑果枸杞精油的抗氧化性

2.2.1黑果枸杞對DPPH自由基的清除作用

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著黑果枸杞精油質(zhì)量濃度的增加，清除率逐漸增大，精油質(zhì)量濃度(x)與清除率(y)的回歸方程為y =6 983.9x+34.556(R2=0.909 )，相關(guān)性達(dá)極顯著水平，IC50(清除率為50%時樣品的濃度)為0.002 21 μg/μL；V–C質(zhì)量濃度(x)與清除率(y)的回歸方程為y =8 840.4x+16.925(R2=0.822 1)，對照品V–C的 IC50為0.003 74 μg/μL 。

2.2.2黑果枸杞精油對羥基自由基的清除作用

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著濃度的升高，對羥基自由基的清除率也隨著增大，當(dāng)黑果枸杞精油質(zhì)量濃度為1.0 μg/μL時，清除能力達(dá)62.65%，精油質(zhì)量濃度(x)與清除率(y)的回歸方程y =6 852.7x- 2.625 (R2=0.963)；V–C質(zhì)量濃度(x)與清除率(y)的回歸方程y =7 982.3x+18.59 8(R2=0.856)。黑果枸杞精油和V–C的IC50分別為0.007 68 和0.003 94 μg/μL。

2.2.3黑果枸杞對ABTS自由基的清除作用

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著黑果枸杞精油質(zhì)量濃度的增加，對ABTS的清除作用也逐漸增強(qiáng)，兩者存在一定的線性關(guān)系，精油質(zhì)量濃度(x)與清除率(y)的回歸方程y =4 511.2x+49.591(R2=0.911 5)；V–C質(zhì)量濃度(x)與清除率(y)的回歸方程為y =7 907.8x+ 17.036（R2=0.860 7 )；黑果枸杞精油和V–C的IC50分別為0.000 09和0.004 17 μg/μL。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)從黑果枸杞精油中分離鑒定出38種化合物，含有脂肪酸類、酯類、雜環(huán)類、酚類、醇類、醛類等成分，其中以有機(jī)酸和酯類為主，占85.696%。黑果枸杞精油中含有多種在食品、醫(yī)藥、化工等方面有重要用途的物質(zhì)，如亞油酸，棕櫚酸，反油酸，2，3–二氫苯并呋喃等?？寡趸栽囼?yàn)結(jié)果表明，黑果枸杞精油具有較好的體外抗氧化性能，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基的IC50分別為0.002 21，0.007 68和0.000 09 μg/μL，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳晨，趙曉輝，文懷秀．黑果枸杞的抗氧化成分分析及抗氧化能力測定[J]．中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31(15)：1305–1306．

[2] 劉永民．維吾爾藥志(下)[M]．烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999．

[3] 劉洋，殷璐，龔桂萍，等．黑果枸杞葉多糖LRLP3的結(jié)構(gòu)、抗氧化活性及免疫活性[J]．高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2016，37(2)：261–268．

[4] Altintas A，Kosar M，Kirimer N，et al．Composition of oils of the essential oils of Lycium barbarum and L. ruthenicum fruits[J]．Chemistry of Natural Compounds，2006，42(1)：24–25．

[5] 石夢菲．菊葉香藜精油的提取、成分分析及抑菌活性研究[D]．拉薩：西藏大學(xué)，2015．

[6] Mishra P K，Shukla R，Singh P，et al．Antifungal，anti–afatoxigenic，and antioxidant efficacy of Jamrosa essential oil for preservation of herbal raw material[J]. Internation Biodeterional&Biodegradation，2012，74：11–16．

[7] 素雅雙，連路宇，劉杰，等．蕪菁多糖提取工藝及清除自由基活性的研究[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40(5)：235–240．

[8] Ye Chunlin，Dai Dehui，Hu Weilian．Antimiorobial and aneioxidant activities of the essential oil from onion (Alliumcepa L.)[J]．Food Control，2013，30(1)：48–53．

[9] 陳莉華，龍進(jìn)國，譚林艷，等．紅果參多糖的提取純化及抗氧化活性研究[J]．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，(25)：170–173．

責(zé)任編輯：尹小紅英文編輯：梁 和

Composition of Lycium ruthenicum and its antioxidation in vitro

Zhao Xiuling, Li Kun
(School of Life and Environment Sciences, Huangshan College, Huangshan, An’hui 245021, China)

Abstract:Volatile oil from Lycium ruthenicum was extracted by steam distillation and its antioxidant activities in vitro were evaluated by scavenging capacity against DPPH free radical, hydroxyl free radical and ABTS free radical, with ascorbic acid (V–C) as the positive control. Then the chemical constituent of the volatile oil were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC–MS). The results showed that: 38 components were isolated and identified from the volatile oil. The main compounds in the volatile oils were linolic acid, Palmitic acid, elaidic acid, 2,3-dihydrobenzofuran, methyl linoleate, 2-methoxy-4-vinyphonol. The acids and esters were the dominant components in the essential oils(which occupied 85.696% of total constituents); the IC50value of scavenging against DPPH free radical, hydroxyl free radical and ABTS free radical were 0.002 21, 0.007 68, 0.000 09 μg/μL, respectively. The antioxidation of volatile oils in vitro had a relation of concentration-dependent.

Keywords:Lycium ruthenicum; volatile oil; gas chromatography-mass spectrometry; chemical constituents; antioxidant

中圖分類號：S567.1+9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007?1032(2016)02?0193?04投稿網(wǎng)址：http://xb.ijournal.cn

收稿日期：2015–09–28 修回日期： 2016–03–10

基金項(xiàng)目：安徽省教育廳項(xiàng)目(KJHS2015B03)；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目(AH2014103753122)；黃山學(xué)院科研項(xiàng)目(2013XKJ002)

作者簡介：趙秀玲(1973—)，女，新疆奇臺人，碩士，講師，主要從事食品功能性研究，zhaoxiuling2008ren@aliyun.com