黃楚恒，李天然，黃曉斌，蔡立杰，盧光明，李延軍

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·論著·

轉(zhuǎn)移相關(guān)基因干擾對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移潛能的影響

黃楚恒1，李天然2，黃曉斌1，蔡立杰1，盧光明3，李延軍3

目的通過干擾高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞(MHCC97-H)中的骨橋蛋白(OPN)、腫瘤增殖性因子腫瘤生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)基因，使之減少OPN、TGFβ1表達(dá)，觀察MHCC97-H轉(zhuǎn)移能力的變化情況。方法對(duì)MHCC97-H細(xì)胞行OPN、TGFβ1基因干擾，qPCR法檢測(cè)干擾效果。MHCC97-H細(xì)胞遷移細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)采用transwells法。肺轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型制作方法：裸鼠尾靜脈注射各組細(xì)胞，含細(xì)胞數(shù)5×106個(gè)/只，隔天連續(xù)注射3次，2周后觀察肺臟組織。離體肺臟組織標(biāo)本制作，DAPI 染核處理10 min，甘油PBS 封片，置于熒光顯微鏡下觀察。免疫熒光法檢測(cè)裸鼠動(dòng)物模型整合素αvβ3 表達(dá)。結(jié)果經(jīng)基因干擾后MHCC97-H表達(dá)OPN和TGFβ1明顯降低(P<0.05)。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示與對(duì)照組比較，經(jīng)OPN和TGFβ-1干擾組MHCC97-H細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少(P<0.01)。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)顯示與對(duì)照組比較，OPN和TGFβ1干擾組肺組織中肝癌細(xì)胞較少，定量分析顯示OPN和TGFβ1干擾組肺臟組織中肝癌細(xì)胞IOD值明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。OPN和TGFβ1干擾組與對(duì)照組比較整合素 αvβ3表達(dá)IOD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論經(jīng)OPN和TGFβ1基因干擾的MHCC97-H細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移能力有明顯的下降，尤其是TGFβ1基因干擾組下降更加明顯，但經(jīng)OPN和TGFβ1基因干擾的MHCC97-H細(xì)胞表達(dá)整合素αvβ3能力無(wú)變化，整合素αvβ3介導(dǎo)參與了OPN和TGFβ1共同作用肝癌轉(zhuǎn)移行為的變化。

肝癌，轉(zhuǎn)移；骨橋蛋白；腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子；整合素

肝癌的轉(zhuǎn)移行為是影響肝癌預(yù)后的關(guān)鍵因素之一，多種生物學(xué)因子參與到了肝癌的轉(zhuǎn)移過程中。復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所構(gòu)建的具有不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌模型成為研究肝癌轉(zhuǎn)移行為的有效手段，具有高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞(MHCC97-H)肺轉(zhuǎn)移率100%。本課題研究組主要關(guān)注對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移潛能的生物干預(yù)，為尋找合適的生物治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。前期通過基因工程技術(shù)對(duì)自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(autologous bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)進(jìn)行改造，使其增加轉(zhuǎn)移性相關(guān)因子骨橋蛋白(osteopontin, OPN)基因表達(dá)、腫瘤增殖性因子腫瘤生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β，TGFβ1)基因的表達(dá)，觀察經(jīng)基因改造的BMSC對(duì)具有不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌的影響情況，研究結(jié)果顯示外源性生物活性因子可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[2-3]。因此，減少生物活性因子的表達(dá)，可能起到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和增殖的作用。本研究通過抑制MHCC97-H中的OPN、TGFβ1基因，使之減少OPN、TGFβ1表達(dá)，觀察肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的變化情況。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器及試劑冰凍切片機(jī)(HM525 NX型，Thermo公司)，正置熒光顯微鏡(BX43 型， OLYMPUS 公司)，冰箱(BCD-211KD3 型, TCL公司)，輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(RM2235 型，LEICA 公司)，病理組織漂烘儀(tec 2500 型，常州市郝思琳儀器設(shè)備有限公司)，轉(zhuǎn)盤式掃描共聚焦顯微鏡(OLYMPUS公司DSU)，冰箱(BCD-211KD3 型, TCL公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(101-3 型，上海錦屏儀器有限公司)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱(PYX-DHS500BS-Ⅱ型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)。鼠多克隆整合素αvβ3抗體(santa，批號(hào)：L2206)，工作濃度為1∶50；驢抗兔熒光二抗(Life，批號(hào)：1531671，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)：490/520 nm)，工作濃度為1∶800；檸檬酸抗原修復(fù)液(pH6.0，福州邁新生物技術(shù)有限公司)；二甲苯(成都市科龍化工試劑廠)；無(wú)水乙醇(成都市科龍化工試劑廠)；DAPI(sigma，吸收波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)：358/461 nm)。DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS，BI公司)，青(p)-鏈霉素(s)(100×P.S.雙抗菌素，杭州昊天生物技術(shù)有限公司)，胰蛋白酶(trypsin，gibco公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司)。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件實(shí)驗(yàn)用BALB/c雄性裸小鼠均由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2012-0002，SPF級(jí)，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為0205939，購(gòu)入時(shí)動(dòng)物體重為20 g左右。飲用水為滅菌二級(jí)超純水，飲用水質(zhì)量符合中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB5749-2006)的規(guī)定。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房使用許可證號(hào)為SYXK(浙)2015-0008，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度范圍20～25 ℃，相對(duì)濕度范圍40%～70%。裸小鼠試驗(yàn)前在動(dòng)物房環(huán)境中適應(yīng)6 d。維持飼料由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB14924.3-2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料營(yíng)養(yǎng)成分》。

1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1MHCC97-H基因干擾方法本課題組前期結(jié)果顯示MHCC97-H高表達(dá)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因OPN和增殖相關(guān)基因TGFβ1，因此，本研究對(duì)兩種基因分別進(jìn)行干擾。實(shí)驗(yàn)方法：腺病毒載體的構(gòu)建，TGFβ1 siRNA1序列：G￣T￣G￣G￣A￣G￣C￣T￣G￣T￣A￣C￣C￣A￣G￣A￣A￣A￣T￣； OPN siRNA1序列：GAGGAGTTGAATGGTGCATAC，合成PAGE膠純化的oligo序列，載體用BamH I，EcoR I雙酶切，切膠回收，退火獲得目的片斷shRNA3’和5’的單鏈，目的片段shRNA與載體連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化后的TGFβ1及OPN shRNA平板挑菌,測(cè)序。重組腺病毒TGFβ1&SPP1 shRNA腺病毒：制備重組質(zhì)粒，重組腺病毒載體的包裝，收毒及擴(kuò)增，TGFβ1及OPN shRNA腺病毒檢驗(yàn)。病毒感染MHCC97-H細(xì)胞。qPCR檢測(cè)基因干擾前后TGFβ1及OPN表達(dá)情況,步驟包括：① Trizol-離心柱法提取細(xì)胞總RNA：收集約106個(gè)細(xì)胞，裂解，離心。② RNA純度的測(cè)定和RNA的定量：以相應(yīng)溶劑為對(duì)照，取2 μL RNA溶液于Merinton SMA4000檢測(cè)，觀察A260/A280、A260/A230比值及連續(xù)波長(zhǎng)吸收峰，并計(jì)算RNA溶液濃度，判斷RNA提取質(zhì)量。③ 逆轉(zhuǎn)錄。④ 熒光定量PCR擴(kuò)增。

1.3.2MHCC97-H細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)設(shè)MHCC97-H空白對(duì)照組、MHCC97-H基因干擾陰性對(duì)照組(native contrast, NC)、MHCC97H TGFβ1基因干擾組、MHCC97-H OPN基因干擾組，用 10%FBS 1×P.S. DMEM 培養(yǎng)基， 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)。取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期各組MHCC97-H細(xì)胞，0.25% Trypsin +0.02%EDTA 消化離心，計(jì)數(shù)后，以 5 ×104/well密度分組鋪 24 孔板上室，下室加入DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后， PBS 清洗 1 次，用4%多聚甲醛固定10 min，取出，用棉簽擦去上室非遷移細(xì)胞，移去transwells，倒置，風(fēng)干，在24孔板中加入200 μL 0.1%結(jié)晶紫，把小室放入其中，室溫孵育10 min，取出，PBS清洗3次，隨機(jī)取3個(gè)視野，照相，計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。1.3.3動(dòng)物模型分組①肝癌肺轉(zhuǎn)移模型動(dòng)物模型共 32 個(gè)樣本，具體分組為： GFP基因陰性對(duì)照組、 OPN基因干擾組、TGFβ1基因干擾組和空白對(duì)照組，每組均 8 個(gè)樣本。②裸鼠整合素(integrin)αvβ3 表達(dá)實(shí)驗(yàn)共15個(gè)樣本，具體分組為：基因陰性對(duì)照(native contrast，NC)組、OPN基因干擾和TGFβ1基因干擾組，每組均5個(gè)樣本。

1.3.4肝癌肺轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型制作方法參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97-H空白對(duì)照細(xì)胞株、MHCC97-H陰性對(duì)照細(xì)胞株、MHCC97-H OPN干擾細(xì)胞株，1000 rpm 離心5 min，調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×107個(gè)/mL，制備單細(xì)胞懸液。32只裸鼠分別自尾靜脈注射0.2 mL，含細(xì)胞數(shù)5×106個(gè)/只，注射后按壓30 s，防止細(xì)胞懸液從針孔流出，隔天連續(xù)注射3次，2周后觀察肺臟組織，復(fù)制肺轉(zhuǎn)移移植瘤模型。

1.3.5肝癌肺轉(zhuǎn)移腫瘤標(biāo)本制作切片方法步驟包括4%甲醛固定3～5 d，修塊，脫水，透明處理，浸蠟，石蠟包埋，6 μm切片，DAPI 染核10 min，甘油PBS 封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.6免疫熒光法檢測(cè)裸鼠動(dòng)物模型整合素(integrin)αvβ3 表達(dá)①二甲苯脫蠟，梯度酒精分步復(fù)水：二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、100%乙醇Ⅰ5 min、100%乙醇Ⅱ5 min、95%乙醇5 min、 80%乙醇5 min、PBS 洗3×3 min。②抗原修復(fù):置0.01M 枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中微波修復(fù)，自然冷卻至室溫，PBS 沖洗3×3 min。③滴加一抗，4 ℃孵育過夜，PBS 水洗3×3 min。④滴加二抗，37 ℃孵育60 min，PBS 沖洗3×5 min。⑤DAPI 染核，室溫10 min。⑥甘油PBS 封片，共聚焦顯微鏡觀察。免疫熒光呈綠色為陽(yáng)性表達(dá)。

2　結(jié)　果

2.1MHCC97-H細(xì)胞基因干擾前后TGFβ1及OPN表達(dá)結(jié)果以β-Action作為內(nèi)參照基因，以空白對(duì)照組(基因干擾前)作為對(duì)照基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后相對(duì)定量，結(jié)果見表1。

表1　TGFβ1及OPN基因干擾前后MHCC97-H細(xì)胞表達(dá)

2.2transwells法遷移MHCC97-H細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組中MHCC97-H NC組遷移細(xì)胞數(shù)為(129.29±12.32)個(gè)，MHCC97-H OPN組遷移細(xì)胞數(shù)為(72.39±11.32)個(gè)，MHCC97-H TGFβ-1組遷移細(xì)胞數(shù)為(39.12±9.65)個(gè)，空白對(duì)照組MHCC97-H遷移細(xì)胞數(shù)為(225.45±17.46)個(gè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組MHCC97-H比較，經(jīng)OPN、TGFβ-1基因干擾MHCC97-H細(xì)胞組及陰性對(duì)照組，細(xì)胞遷移數(shù)量組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明經(jīng)基因干擾后細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少，尤其是MHCC97-H OPN和MHCC97-H TGFβ1干擾組細(xì)胞遷移數(shù)量減少為著(P<0.01)。

2.3高轉(zhuǎn)移肝癌(MHCC97-H)動(dòng)物模型肺轉(zhuǎn)移情況熒光成像結(jié)果(圖1)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組肺臟組織中腫瘤細(xì)胞較多，OPN干擾組和TGFβ1對(duì)照組肺組織中腫瘤細(xì)胞與空白對(duì)照組比較較少，表明經(jīng)基因干擾MHCC97-H腫瘤肺轉(zhuǎn)移潛能下降。為進(jìn)一步定量觀察肺組織細(xì)胞中肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況，利用Image J軟件對(duì)病理切片中肝癌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，以細(xì)胞積分光密度(integrated option density，IOD)作為定量指標(biāo)，見圖2。

圖1　 MHCC97-H腫瘤動(dòng)物模型肺組織轉(zhuǎn)移情況熒光成像(腫瘤細(xì)胞呈紅色，肺組織細(xì)胞核呈藍(lán)色)

NC: 陰性對(duì)照組；OPN：OPN基因干擾組；TGFβ1：TGFβ1基因干擾組；MHCC97-H空白對(duì)照組圖2　肺臟組織中轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞熒光成像定量分析

利用Image J軟件對(duì)肺臟中肝癌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，兩組實(shí)驗(yàn)組(OPN干擾組和TGFβ1基因干擾組)與空白對(duì)照組和陰性基因?qū)φ战M比較肝癌細(xì)胞IOD值較低(P<0.05)，表明經(jīng)OPN和TGFβ1基因干擾后轉(zhuǎn)移能力相減弱，與鏡下觀察結(jié)果一致。

2.4經(jīng)基因修飾的MHCC97-H動(dòng)物模型病理切片轉(zhuǎn)移相關(guān)因子整合素αvβ3熒光成像表達(dá)整合素αvβ3免疫熒光陽(yáng)性顯色綠色為陽(yáng)性(圖3)。

圖3　經(jīng)基因修飾的MHCC97-H動(dòng)物模型轉(zhuǎn)移相關(guān)因子整合素αvβ3熒光成像表達(dá)

由鏡下可見，兩組基因干擾組與對(duì)照組比較表達(dá)綠色熒光肝癌細(xì)胞密度明顯減少。利用Image J軟件對(duì)肺臟中肝癌細(xì)胞表達(dá)整合素αvβ3的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，細(xì)胞IOD值在三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明經(jīng)OPN和TGFβ1基因干擾的肝癌細(xì)胞表達(dá)整合素αvβ3能力無(wú)變化(圖4)。

OPN：OPN基因干擾組；TGFβ1：TGFβ1基因干擾組；NC：陰性對(duì)照組　　圖4　肺臟組織中肝癌細(xì)胞表達(dá)整合素αvβ3熒光成像定量分析

3　討　論

肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤，死亡率占惡性腫瘤的第3位，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是肝癌預(yù)后差的主要原因[6-7]。人肝癌細(xì)胞株MHCC97-H是具有高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株，其肺轉(zhuǎn)移能力達(dá)到100%，該細(xì)胞株是研究肝癌肺轉(zhuǎn)移的最佳模型。肝癌的轉(zhuǎn)移行為與多種因素有關(guān)，肝癌侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因、多步驟、多因素參與的復(fù)雜過程，涉及癌細(xì)胞間以及癌細(xì)胞與宿主微環(huán)境間復(fù)雜的相互作用。

本課題組注意到OPN是一種分泌型磷酸化糖蛋白，其分子結(jié)構(gòu)中含有RGD(Arg-Gly-Asp)多肽序列。OPN通過與整合素αvβ3或CD44結(jié)合，參與細(xì)胞粘附、信號(hào)傳導(dǎo)、運(yùn)動(dòng)等重要的生物學(xué)過程，但具體的機(jī)制仍在研究之中。研究發(fā)現(xiàn)，OPN在伴轉(zhuǎn)移的肝癌組織中顯著高表達(dá)，提示OPN參與了肝癌的轉(zhuǎn)移行為，通過阻斷OPN的表達(dá)可以延緩肝癌的轉(zhuǎn)移。另外，TGFβ1是參與腫瘤的增值、侵襲轉(zhuǎn)移重要生物因子，在肝癌的增殖和轉(zhuǎn)移中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子與肝癌的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)[10]。因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，通過基因工程技術(shù)干擾MHCC97-H中OPN和TGFβ1基因，減少兩種生物活性因子表達(dá)，觀察對(duì)MHCC97-H細(xì)胞及肝癌模型轉(zhuǎn)移能的影響。

細(xì)胞學(xué)水平觀察采用transwells法進(jìn)行，模擬組織的基底膜結(jié)構(gòu)。腫瘤實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移突破基底膜是最為關(guān)鍵的一步，突破基底膜的能力代表腫瘤的轉(zhuǎn)移能力。動(dòng)物模型水平主要是復(fù)制高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移模型，通過尾靜脈注射經(jīng)基因干擾前后的MHCC97-H細(xì)胞，40 d后觀察肝癌的肺轉(zhuǎn)移情況。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示經(jīng)基因干擾的MHCC97-H細(xì)胞遷移能力明顯下降，尤其是TGFβ1干擾的MHCC97-H細(xì)胞，表明與OPN相比TGFβ1因子更多地參與了肝癌的轉(zhuǎn)移行為。有研究認(rèn)為[11-12]，TGFβ1過度表達(dá)可導(dǎo)致對(duì)免疫細(xì)胞包括T、B淋巴細(xì)胞過度抑制，使機(jī)體的免疫監(jiān)督功能大大降低, 對(duì)外來(lái)病原體免疫應(yīng)答、免疫清除能力下降，對(duì)腫瘤細(xì)胞的清除作用降低，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步探究經(jīng)基因干擾的MHCC97-H細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能變化的生物學(xué)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵生物學(xué)分子整合素αvβ3表達(dá)情況進(jìn)行分析，對(duì)病理切片預(yù)處理后進(jìn)行熒光成像觀察，結(jié)果顯示經(jīng)基因干擾的實(shí)驗(yàn)組(OPN和TGFβ1基因干擾組)肺臟中轉(zhuǎn)移性肝癌病理組織整合素αvβ3的表達(dá)能力無(wú)明顯變化，這可能與整合素αvβ3表達(dá)不僅僅在轉(zhuǎn)移性肝癌中表達(dá)，腫瘤組織中血管內(nèi)皮也有整合素αvβ3表達(dá)有關(guān)。整合素αvβ3介導(dǎo)了肝癌轉(zhuǎn)移行為的變化，周建平等[13]研究結(jié)果表明整合素αv表達(dá)變化，代表了肝癌的肝癌轉(zhuǎn)移能力的變化。有研究證實(shí)[14]，TGFβ1因子與整合素αvβ3受體在腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路上具有聯(lián)系，即整合素與TGFβ受體介導(dǎo)的兩條信號(hào)傳導(dǎo)通路不僅共用某些信號(hào)分子，而且共同作用于多種生物效應(yīng)并相互促進(jìn)。OPN分子結(jié)構(gòu)中含有RGD多肽序列，主要通過與其受體整合素αvβ3和CD44相互作用，參與腫瘤轉(zhuǎn)移過程[15]。TGFβ1、OPN與整合素αvβ3之間的關(guān)系中，主要OPN介導(dǎo)整合素與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)黏附，成為腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，而TGFβ1通過上調(diào)整合素關(guān)聯(lián)蛋白激酶(integrin-linked kinase, IKL)的表達(dá)而激活蛋白激酶B和TGFβ1提高黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)酪氨酸的磷酸化水平，激活下游的信號(hào)分子直接或間接地參與整合素與ECM黏附，促進(jìn)肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移。也有學(xué)者認(rèn)為，OPN通過介導(dǎo)TGFβ1依賴性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化機(jī)制，而促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[16]。另有學(xué)者也進(jìn)行了TGFβ與MHCC97-H轉(zhuǎn)移的關(guān)系的研究，結(jié)果表明，TGFβ家族中TGFβRⅡ的高表達(dá)能抑制MHCC97-H 的增殖和遷移侵襲，認(rèn)為其機(jī)制可能與TGFβRⅡ高表達(dá)后激活TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，改變細(xì)胞的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)能力有關(guān)[17]。因此，本研究中經(jīng)OPN、TGFβ1基因干擾的MHCC97-H細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的下降主要與OPN和TGFβ1表達(dá)減少有關(guān)，而與轉(zhuǎn)移性肝癌組織整合素αvβ3表達(dá)無(wú)關(guān)。

通過基因干擾方法抑制肝癌細(xì)胞或組織的OPN和TGFβ1表達(dá)，無(wú)論從細(xì)胞學(xué)水平和動(dòng)物模型水平，肝癌的轉(zhuǎn)移能力均有明顯的下降，尤其是TGFβ1基因干擾組下降更加明顯，轉(zhuǎn)移相關(guān)因子整合素αvβ3表達(dá)無(wú)明顯變化，本研究中經(jīng)OPN、TGFβ1基因干擾的MHCC97-H細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的下降主要與OPN和TGFβ1表達(dá)減少有關(guān)，而與轉(zhuǎn)移性肝癌組織整合素αvβ3表達(dá)無(wú)關(guān)。

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(本文編輯：張仲書；英文編輯：王建東)

Effect ofsilence of associated metastasis gene on hepatocellular carcinoma metastasis

HUANG Chu-heng1， LI Tian-ran2， HUANG Xiao-bin1，CAILi-jie1，LUGuang-ming3，LIYan-jun3.

1.DepartmentofRadiology，95HospitalofPLA,Putian,Fujian351100,China; 2.DepartmentofRadiology,theFirstAffiliatedHospitalofPLAGeneralHospital,Beijing, 100048,China; 3.DepartmentRadiology,NanjingGeneralHospitalofPLA,Nanjing,Jiangsu210002,China

ObjectiveTo observe the change of metastasis ability of hepatocellular carcinoma by inhibiting OPN, TGFβ1 gene expression of the high metastatic potential of hepatocellular carcinoma cells (MHCC97-H). MethodsOPN and TGFβ1 gene silencing were made in the MHCC97-H cells and qPCR was used to test the expression of MHCC97-H cells. MHCC97-H cells migration experiment used transwells assay. Lung metastasis animal model making method: MHCC97-H cells were injected into the tail vein of nude mice three times every two days, and 0.2 mL cells suspension contained 5 × 106cells, and the lung tissue was observed after 2 weeks. Lung tissue samples: DAPI nuclear stainined for 10 min, glycerol PBS mounted, and observed under fluorescent microscope. Nude mice animal model of integrin αvβ3 expression was detected by immunofluorescence. ResultsOPN and TGFβ-1 expression of MHCC97-H by genes silencing significantly decreased (P<0.05). Compared with the control group, the cells migration of MHCC97-H OPN and TGFβ-1 genes silencing groups significantly decreased (P<0.01). Animal model experiments showed that there were less tumor cells in the lung tissue of the OPN and the TGFβ1 gene silence group compared with the control group. The results of quantitative analysis showed that the IOD value of the blank control group and the negative control group was greater than the two experimental groups, and the difference was statistically significant (P<0.05). Compared with the control group, the IOD of integrin alpha v beta 3 expression in two genes silencing groups wasn’t significantly different. ConclusionFrom the level of cytology and animal model results, there was significant decrease in the metastatic ability of MHCC97-H cell by genes silencing, especially in the TGFβ1 gene si-lencing group. The expression ability of related metastasis factor integrinαvβ3 had no change, and it suggests that integrin αvβ3 mediates the role of OPN and TGFβ1 in HCC metastasis.

HCC, metastasis; OPN; TGFβ1; integrin

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81271607); 南京軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生重點(diǎn)資助項(xiàng)目(11Z035);國(guó)家博士后基金(2015M572810)

1. 351100福建莆田，解放軍95醫(yī)院放射科；2. 100048北京，解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院放射科； 3. 210002江蘇南京，南京總醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科

李天然， E-mail: lizhaoruixin@sina.com

R735.7

A

10.3969/j.issn.1672-271X.2016.03.001

2016-02-20；

2016-04-16)

引用格式：黃楚恒，李天然，黃曉斌,等.轉(zhuǎn)移相關(guān)基因干擾對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移潛能的影響.東南國(guó)防醫(yī)藥，2016,18(3):225-229,236.