張 鈺，王棟芳，曹 冰，羅世恒，劉雅瓊，黃寧華，閆賴賴，王京宇*

1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100191 2.島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司，北京 100020

GC-MS測(cè)定血清膽固醇及其標(biāo)志物前處理?xiàng)l件正交試驗(yàn)優(yōu)化研究

張 鈺1，王棟芳1，曹 冰1，羅世恒2，劉雅瓊1，黃寧華1，閆賴賴1，王京宇1*

1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100191 2.島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司，北京 100020

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化GC-MS測(cè)定血清膽固醇及其標(biāo)志物的樣品前處理?xiàng)l件，并對(duì)最優(yōu)試驗(yàn)方案進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。采用L16(211)正交設(shè)計(jì)對(duì)影響GC-MS測(cè)定血清膽固醇及其標(biāo)志物前處理的3個(gè)關(guān)鍵步驟共7個(gè)因素——皂化(KOH-乙醇濃度、皂化溫度和時(shí)間)、萃取(正己烷用量)和衍生化(衍生化溫度、時(shí)間和用量)進(jìn)行優(yōu)化。得到最優(yōu)前處理?xiàng)l件組合如下：KOH-乙醇溶液濃度為1 mol·L-1； 皂化溫度70 ℃； 皂化時(shí)間60 min； 萃取劑用量2 mL； 衍生化溫度70 ℃； 衍生化時(shí)間60 min； 衍生化試劑用量100 μL。所建方法準(zhǔn)確性和精密性良好，方法學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道。

GC-MS； 正交試驗(yàn)； 膽固醇； 標(biāo)志物； 前處理

引 言

膽固醇是機(jī)體內(nèi)重要的代謝組分之一，與人體健康和疾病密切相關(guān)。膽固醇的代謝與吸收是調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇平衡的兩個(gè)重要途徑[1]，人體血清中含有如角鯊烯、2,4-脫氫膽固醇等膽固醇合成前體，可作為膽固醇合成標(biāo)志物用于反映機(jī)體內(nèi)源性膽固醇合成效率； 還含有如菜油固醇、β-谷固醇等植物固醇，可作為膽固醇吸收標(biāo)志物用于反映機(jī)體外源性膽固醇吸收效率。將上述膽固醇合成標(biāo)志物與膽固醇吸收標(biāo)志物統(tǒng)稱為膽固醇標(biāo)志物[2-5]。膽固醇標(biāo)志物的檢測(cè)已應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、高膽固醇血癥等疾病的檢驗(yàn)[2-4]。因此，血清膽固醇標(biāo)志物水平可以反映機(jī)體膽固醇合成與吸收狀態(tài)并解釋膽固醇水平變化的原因，可作為部分疾病預(yù)防及臨床檢驗(yàn)的重要指標(biāo)。

目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)血清膽固醇標(biāo)志物較為常用的方法有氣相色譜同位素稀釋質(zhì)譜法[6]、液相色譜同位素稀釋質(zhì)譜法[7]、高效液相色譜法[8]、高效氣相色譜法[9]等。由于膽固醇及其標(biāo)志物彼此之間化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)極其相似，且血清中標(biāo)志物含量較低與膽固醇含量相差較大，用上述方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)較難實(shí)現(xiàn)完全分離。GC-MS(gas chromatography-mass spectrometer)以其靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)在痕量檢測(cè)方面具有很大優(yōu)勢(shì)，但該方法在同時(shí)檢測(cè)血清膽固醇及其標(biāo)志物檢測(cè)方面的研究報(bào)道較少且方法研究中未分析影響因素間的交互作用。在GC-MS檢測(cè)中最為重要的是樣品前處理。故采用正交試驗(yàn)對(duì)GC-MS測(cè)定血清膽固醇及其標(biāo)志物的前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化和分析，并對(duì)優(yōu)化后的前處理過(guò)程進(jìn)行評(píng)價(jià)，為膽固醇相關(guān)疾病的檢測(cè)提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GC MS-QP 2010 Ultra型氣質(zhì)聯(lián)用儀(島津(中國(guó))有限公司)； AOC-20i型自動(dòng)進(jìn)樣器(島津(中國(guó))有限公司)； AY120電子天平(0.1 mg，島津(中國(guó))有限公司)； HQ-60旋渦混合器(北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司)； HGC-12A氮?dú)獯祾邇x(天津恒奧科技發(fā)展公司)； ON-450電熱恒熱干燥箱(ASONE株式會(huì)社)； B-490恒溫水溫箱(BUCHI公司)； LD5-2A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品(99%)； 2,4-脫氫膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品(87.3%)； 菜油固醇標(biāo)準(zhǔn)品(≈65%)； β-谷固醇標(biāo)準(zhǔn)品(97%)； 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品(97.7%)； 內(nèi)標(biāo)5α-膽甾烷標(biāo)準(zhǔn)品(10mg/dl)； 衍生化試劑(HMDS+TMCS+Pyridine=3∶1∶9)，以上試劑均購(gòu)自Sigma公司； 正己烷(99.9%分析純，賽默飛世爾科技有限公司)、氫氧化鉀(≥82.0%分析純，北京化工廠)、無(wú)水乙醇(99.9%分析純，韓國(guó)德山藥品工業(yè))，超純水(25 ℃電阻率18.2 MΩ·cm，Milli-Q Reference型超純水系統(tǒng))。

經(jīng)醫(yī)院體檢健康的成年人空腹靜脈血清，置-20 ℃冷藏備用。

1.2 正交試驗(yàn)因素及水平

GC-MS測(cè)定血清膽固醇及其標(biāo)志物前處理過(guò)程中最關(guān)鍵三個(gè)環(huán)節(jié)，即皂化、萃取和衍生化。通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)以上關(guān)鍵環(huán)節(jié)的試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化?？紤]因素間存在交互作用，故選用L16(211)正交表，考察7個(gè)獨(dú)立因素(A.皂化劑KOH-乙醇濃度、B.皂化溫度、C.皂化時(shí)間、D.萃取劑用量、E.衍生化溫度、F.衍生化時(shí)間、G.衍生化試劑用量)以及4個(gè)交互作用(A×B，B×C，A×C和E×F)對(duì)樣品前處理在GC-MS測(cè)定血清膽固醇及其標(biāo)志物過(guò)程中的影響，上述各因素的水平設(shè)定參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-12]。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平

1.3 溶液配制

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：精確稱取角鯊烯、2,4-脫氫膽固醇、菜油固醇、β-谷固醇和膽固醇的標(biāo)準(zhǔn)品，以正己烷為溶劑分別配制并逐級(jí)稀釋成一系列濃度梯度的混標(biāo)溶液(表2)，置-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

表2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度系列(mg·L-1)

(2)內(nèi)標(biāo)溶液配制：精密稱取5α-膽甾烷標(biāo)準(zhǔn)品，以正己烷為溶劑配制內(nèi)標(biāo)溶液濃度為0.5×10-2mg·L-1，置4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品處理

取血清樣品100 μL于10 mL離心管中，加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液和1 mL KOH-乙醇溶液，渦旋混勻30 s后置于水浴鍋中進(jìn)行皂化反應(yīng)。冷卻至室溫后，加1 mL超純水和一定量正己烷，渦旋1 min，3 500 r·min-1離心3 min，取上清，重復(fù)兩次合并上清。N2吹干(40 ℃)后加入衍生化試劑，渦旋30 s，置烘箱中反應(yīng)，冷卻至室溫后N2吹干，加入600 μL正己烷復(fù)溶，渦旋混勻30 s，3 500 r·min-1離心3 min，取上清至樣品瓶，分析備用。

正交實(shí)驗(yàn)按照基本過(guò)程操作，其中KOH-乙醇溶液濃度、皂化溫度、皂化時(shí)間、正己烷用量、衍生化溫度、衍生化時(shí)間和衍生化試劑用量等按照表1正交設(shè)計(jì)水平進(jìn)行。

1.5 儀器測(cè)定條件

表3 特征離子與定量離子

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用島津公司GC-MS postrun analysis軟件測(cè)定各組分峰面積，對(duì)正交試驗(yàn)所得各組分峰面積進(jìn)行百分制處理和賦予等權(quán)重處理，依次進(jìn)行結(jié)果直觀分析和多因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

按照L16(211)正交表設(shè)計(jì)且考慮因素間交互作用，共有16個(gè)試樣，均按照1.4所述操作，分別將各組分以各自峰面積最大值為100進(jìn)行百分制轉(zhuǎn)換，對(duì)每個(gè)試樣各組分百分制得分等權(quán)重加權(quán)平均，得到該試樣綜合得分(Y)，并對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表4)。

極差直觀分析可知各因素對(duì)結(jié)果影響大小的依次順序是：C>B>E>A>F>E×F>B×C>G>A×C>D>A×B，根據(jù)每一因素各自試驗(yàn)結(jié)果指標(biāo)的均值(Ⅰ，Ⅱ)可以判斷因素的最優(yōu)水平，第一水平為最優(yōu)的因素有A×C和D，其他因素均為第二水平為最優(yōu)水平。

方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)KOH-乙醇溶液濃度、皂化溫度、皂化時(shí)間、皂化溫度與皂化時(shí)間的交互作用、衍生化溫度、衍生化時(shí)間和衍生化溫度與衍生化時(shí)間的交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，而KOH-乙醇溶液濃度與皂化溫度的交互作用、KOH-乙醇溶液濃度與皂化時(shí)間的交互作用、萃取劑用量和衍生化試劑用量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表5)。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 方差分析結(jié)果

F0.05(1, 1)=161.00

分別對(duì)皂化反應(yīng)、衍生化反應(yīng)溫度與時(shí)間的交互作用做進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)皂化條件的最佳組合為70 ℃，60 min； 衍生化條件的最佳組合為70 ℃，60 min(表6)。

通過(guò)正交試驗(yàn)得出GC-MS測(cè)定血清膽固醇及其標(biāo)志物的最優(yōu)前處理?xiàng)l件為：KOH-乙醇溶液濃度為1 mol·L-1，皂化溫度70 ℃，皂化時(shí)間60 min，萃取劑正己烷用量為2 mL，衍生化溫度70 ℃，衍生化時(shí)間60 min，衍生化試劑用量100 μL。將最優(yōu)前處理?xiàng)l件代入1.4所述基本過(guò)程中，建立GC-MS測(cè)定血清膽固醇及其標(biāo)志物的方法。

表6 因素交互作用結(jié)果

2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 線性關(guān)系與檢出限

分別取表2中標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度系列1～6號(hào)100 μL，采用正交設(shè)計(jì)分析得到的最優(yōu)前處理方案，按照1.4所述逐步操作，以各組分與內(nèi)標(biāo)的濃度比為橫坐標(biāo)，以峰面積比值為縱坐標(biāo)進(jìn)行擬合，分別計(jì)算線性回歸方程，各組分在梯度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以信噪比S/N=3為衡量標(biāo)準(zhǔn)，所對(duì)應(yīng)的濃度為各組分最低檢出限(表7)，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2.2 日內(nèi)精密度

采用正交試驗(yàn)分析所得最優(yōu)前處理方案，按照1.4所述逐步操作，連續(xù)測(cè)定3次，計(jì)算角鯊烯、2,4-脫氫膽固醇、菜油固醇、β-谷固醇和膽固醇的日內(nèi)精密度，分別為1.73，1.84，2.04，1.76和1.91，均在2.1%以下，表明該方法日內(nèi)精密度良好。

表7 回歸方程及線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限

圖1 GC-MS測(cè)定膽固醇及其標(biāo)志物TIC色譜圖

2.2.3 日間精密度

采用正交試驗(yàn)分析所得最優(yōu)前處理方案，按照1.4所述逐步操作，連續(xù)測(cè)定5天，計(jì)算角鯊烯、2,4-脫氫膽固醇、菜油固醇、β-谷固醇和膽固醇的日間精密度，分別為7.47，2.41，4.26，4.20和4.48，均在10%以下，表明該方法日間精密度良好。

2.2.4 回收率

取健康人血清100 μL，按照1.4所述處理并測(cè)定血清中各組分濃度，另分別取該血清100 μL加入低、中、高3個(gè)水平100 μL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1號(hào)、3號(hào)、5號(hào)梯度混標(biāo)溶液)，按照1.4所述處理，計(jì)算平均回收率及RSD%，結(jié)果顯示各目標(biāo)物的平均回收率均在97.96%～102.76%之間且RSD%均小于4%(表8)。

表8 回收率結(jié)果

2.3 正交試驗(yàn)

皂化：常采用堿性醇溶液(KOH-乙醇溶液)使結(jié)合固醇水解為游離狀態(tài)以測(cè)得血清中固醇類成分總量[10]，另外皂化是一種化學(xué)反應(yīng)，其反應(yīng)程度受時(shí)間與溫度的影響，故對(duì)以上因素進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KOH-乙醇溶液濃度、皂化溫度和皂化時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異且皂化溫度與時(shí)間的交互作用對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，皂化60 ℃ 45 min與60 ℃ 60 min結(jié)果相比差異較大，而皂化70 ℃ 45 min與70 ℃ 60 min結(jié)果相比差異較小，皂化溫度越高皂化反應(yīng)越快，在本試驗(yàn)時(shí)間和溫度范圍內(nèi)，時(shí)間越長(zhǎng)溫度越高，皂化效果越好，皂化70 ℃，60 min為最佳條件。

萃?。耗懝檀技捌錁?biāo)志物均為脂溶性物質(zhì)，在皂化反應(yīng)完成后需采用液相萃取的方法將其從溶劑中萃取出來(lái)。萃取前加入超純水可使水相與正己烷相分層更顯著，萃取重復(fù)進(jìn)行兩次以保證最大程度將待測(cè)物溶出，考慮到萃取劑正己烷用量對(duì)萃取結(jié)果存在影響，故對(duì)其進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正己烷用量在多于2 mL時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，故采用2 mL正己烷進(jìn)行萃取以避免試劑不必要的浪費(fèi)和縮短后續(xù)N2吹干時(shí)間。

衍生化：衍生化反應(yīng)能夠提高檢測(cè)物靈敏度和穩(wěn)定性，降低色譜柱壁對(duì)樣品的吸附作用，有利于結(jié)構(gòu)相似的組分彼此分離[13]。衍生化反應(yīng)的影響因素主要有衍生化溫度、衍生化時(shí)間和衍生化試劑用量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)衍生化溫度和時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且衍生化溫度與時(shí)間之間存在交互作用，60 ℃衍生化45 min與60 ℃衍生化60 min相比差異較大，而70 ℃衍生化45 min與70 ℃衍生化60 min相比差異較小，溫度在對(duì)衍生化反應(yīng)程度的影響中發(fā)揮更大的作用，在本試驗(yàn)時(shí)間和溫度范圍內(nèi)，時(shí)間越長(zhǎng)溫度越高，皂化效果越好，衍生化70 ℃ 60 min的測(cè)定結(jié)果為最佳條件。衍生化試劑用量在多于100 μL時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

優(yōu)化后的樣品前處理方法不僅可以對(duì)各組分進(jìn)行較好的分離和測(cè)定，且該方法線性擬合度、精密性、穩(wěn)定性和回收率均較好。除膽固醇外，其余各組分相關(guān)系數(shù)r值均大于0.999 6； 膽固醇回歸方程r值為0.998 8，其原因可能是由于膽固醇濃度遠(yuǎn)大于內(nèi)標(biāo)和其他組分濃度而使擬合度不如其他組分； 該方法測(cè)得各組分日內(nèi)精密度均在2.1%以下，各組分日間精密度均在10%以下，各組分回收率均值均在97.96%～102.76%之間且RSD%均小于4%。與同類方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果相比，該研究各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度更高； 檢出限除角鯊烯略高外，其他組分均低于文獻(xiàn)報(bào)道3～10倍； 各組分日內(nèi)精密度與日間精密度均優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道； 膽固醇回收率與文獻(xiàn)報(bào)道持平，其余組分回收率均優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道(表9)。

表9 同類文獻(xiàn)方法學(xué)結(jié)果對(duì)比

3 結(jié) 論

采用正交試驗(yàn)對(duì)GC-MS測(cè)定血清膽固醇及其標(biāo)志物的前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，探討了前處理主要影響因素及因素間交互作用對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。所建方法具有良好的靈敏度和準(zhǔn)確性，能夠同時(shí)測(cè)定角鯊烯、2,4-脫氫膽固醇、菜油固醇、β-谷固醇和膽固醇濃度，且方法學(xué)評(píng)價(jià)的大部分指標(biāo)優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道。該方法為機(jī)體代謝過(guò)程中膽固醇及其標(biāo)志物相互關(guān)系的研究奠定了較為可靠的分離測(cè)定基礎(chǔ)。

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(Received Mar.12, 2015; accepted Jul.16, 2015)

*Corresponding author

Orthogonal Experiment for Optimization of the Sample Pretreatment Conditions for the Serum Cholesterol and Markers Determination by GC-MS

ZHANG Yu1，WANG Dong-fang1，CAO Bing1，LUO Shi-heng2，LIU Ya-qiong1，HUANG Ning-hua1，YAN Lai-lai1，WANG Jing-yu1*

1.School of Public Health, Peking University, Beijing 100191, 2.Shimadzu(China)Co., Ltd., Beijing 100020, China

The objective is to use orthogonal experiment to optimize the pretreatment on the determination of serum cholesterol and its markers by GC-MS.And then the method is evaluated in a methodological perspective.The methodis to Use L16(211) orthogonal experiment design to observe the influence of three key steps，althogether seven factors of pretreatment, which are saponification (KOH ethanol solution concentration, temperature and time), extraction (dose) and derivatization (temperature , time and dose).As for the results，the conditions of optimal pretreatment are as follows：the ethanol solution is 1 mol·L-1KOH, the saponification temperature is 70 ℃；the saponification time is 60 min；the Solvent quantity is 2 mL； the derivatization temperature is 70 ℃；the derivatization time is 60 min，and the derivatization agent is 100 μL.Through the optimization by orthogonal design and methodological evaluation, the determination of serum cholesterol and its markers by GC-MS is excellent in terms of accuracy and precision, and methodological evaluation indexes are better than those reported in other papers.

GC-MS; Orthogonal experiment; Cholesterol; Markers; Pretreatment

2015-03-12，

2015-07-16

北京大學(xué)醫(yī)學(xué)交叉學(xué)科種子基金項(xiàng)目(BMU20140435)資助

張 鈺，女，1989年生，北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院碩士研究生 e-mail: zhangyu2012pku@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: wjy@bjmu.edu.cn

R113

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)05-1488-06