黃祖芳，曹 剛，孫 艷，杜生榮，李永增，

林居強(qiáng)1，馮尚源1，雷晉萍1

拉曼光譜技術(shù)研究男性生殖生育

黃祖芳1*，曹 剛1，孫 艷2，杜生榮2，李永增1，

林居強(qiáng)1，馮尚源1，雷晉萍1

1.福建師范大學(xué)，醫(yī)學(xué)光電科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省光子技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350007 2.福建省婦幼保健院生殖研究室，福建 福州 350001

拉曼光譜通過記錄光與物質(zhì)作用時(shí)頻率的改變，進(jìn)而獲得物質(zhì)分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)信息，從而實(shí)現(xiàn)物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)及其變化的檢測(cè)。相比于常規(guī)生化檢測(cè)分析方法，拉曼光譜技術(shù)具有無損、非標(biāo)記檢測(cè)及對(duì)檢測(cè)樣品要求低等優(yōu)點(diǎn)。拉曼光譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究，如人體組織、器官、細(xì)胞以及人體體液的各種疾病診斷、檢測(cè)研究。本文主要綜述了拉曼光譜技術(shù)在人體精液的研究進(jìn)展，首先介紹了拉曼光譜技術(shù)(包含表面增強(qiáng)拉曼光譜)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域針對(duì)精液整體開展的研究及相關(guān)的數(shù)據(jù)處理方法，然后重點(diǎn)介紹拉曼光譜在男性生殖生育方面的研究，即分別介紹了可客觀反映精液質(zhì)量及男性生殖生育能力的基于精液(精漿)拉曼光譜的定性和定量檢測(cè)分析；另外，介紹了基于顯微拉曼光譜技術(shù)開展的單精子水平的精子質(zhì)量的刻畫和評(píng)估，以及目前研究初步獲得的有望用于優(yōu)質(zhì)精子判別的拉曼光譜標(biāo)記指標(biāo)，最后展望了拉曼光譜技術(shù)在生殖生育領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展前景。

精子；精漿；拉曼光譜；表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)；診斷檢測(cè)；定量分析

引 言

精液是男性特征性的體液，包含細(xì)胞(精子)和非細(xì)胞(精漿)兩部分，精液中精子占5%左右，其余為精漿。精漿主要含有果糖、蛋白質(zhì)、多肽、以及糖類(如葡萄糖，果糖)、酶類(如前列腺素)、無機(jī)鹽和有機(jī)小分子等。

以精液為對(duì)象的研究目前主要涉及法醫(yī)學(xué)研究和男性生殖生育的研究。法醫(yī)學(xué)中關(guān)于性犯罪現(xiàn)場(chǎng)的人體精液的證據(jù)收集及不同體液中痕量精液的無損、準(zhǔn)確鑒別對(duì)于罪犯身份的確定有著至關(guān)重要的作用。精液法醫(yī)學(xué)鑒定和男性生育能力的精液精子質(zhì)量評(píng)估均涉及專業(yè)技術(shù)操作，往往需要進(jìn)行DNA的分析鑒定，專業(yè)要求高，對(duì)樣品檢測(cè)存在有損操作；而男性生殖生育研究方面，開展精液(包含精子和精漿)的質(zhì)量檢測(cè)是目前男性生育能力的重要評(píng)估依據(jù)。目前臨床精子精液檢查主要包括精液常規(guī)分析、精子形態(tài)學(xué)染色分析、精子頂體反應(yīng)分析、精子核DNA碎片分析、抗精子抗體(AsAb)檢測(cè)、精漿生化分析等。精液的分析結(jié)果容易受射精頻度，溫度，實(shí)驗(yàn)條件，檢驗(yàn)人員的技術(shù)熟練程度，主觀判斷能力等諸多因素影響，導(dǎo)致結(jié)果容易發(fā)生偏差，而精漿生化的分析檢測(cè)存在操作步驟繁雜，檢測(cè)耗時(shí)等問題。

拉曼光譜是基于拉曼散射效應(yīng)的光譜技術(shù)，屬于光的非彈性散射現(xiàn)象，通過記錄光與物質(zhì)作用過程中物質(zhì)分子振動(dòng)能級(jí)的改變，進(jìn)而獲得反映分子結(jié)構(gòu)及成分特征性的光譜信息。相比于彈性散射，物質(zhì)分子的拉曼散射效應(yīng)通常很微弱，因而拉曼光譜技術(shù)的早期應(yīng)用與發(fā)展受到很大的限制，隨著光電檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，常規(guī)拉曼光譜系統(tǒng)亦可獲得強(qiáng)熒光背景干擾下的生物組織的拉曼光譜，如采用長(zhǎng)波長(zhǎng)的光激發(fā)，更好的干擾光過濾技術(shù)，更加靈敏的信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)等。此外，值得一提的是，表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)技術(shù)，其通過測(cè)定吸附于粗糙金屬表面的樣品而實(shí)現(xiàn)拉曼信號(hào)的增強(qiáng)，克服常規(guī)拉曼散射截面小的缺點(diǎn)，進(jìn)而提供更加豐富、靈敏的物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)信息。目前，拉曼光譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于組織，細(xì)胞及生物分子水平的檢測(cè)研究，成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要研究手段之一[1]，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。近年拉曼光譜技術(shù)應(yīng)用于人體體液的檢測(cè)研究備受關(guān)注，其中，基于拉曼技術(shù)的體液成分含量檢測(cè)[2]，體液中“痕量”藥物的分析檢測(cè)[3-4]，以及基于體液拉曼光譜的疾病檢測(cè)診斷[5-8]等取得很好的進(jìn)展，有望為臨床生化檢測(cè)和基于體液的人體疾病無損、快速診斷研究提供新方法，開拓新方向。

本文主要綜述了拉曼光譜技術(shù)在精液(精液整體、精漿及精子)研究的情況，即拉曼光譜技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中精液來源的鑒定和區(qū)分，以及拉曼光譜技術(shù)在臨床男性生殖生育的研究應(yīng)用新進(jìn)展，最后展望了基于拉曼光譜技術(shù)的精液研究的發(fā)展前景。

1 精液拉曼光譜分析在法醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面的研究

拉曼光譜技術(shù)具備無損、不受水的干擾、可提供分析物“指紋”信息等優(yōu)點(diǎn)，使其在法醫(yī)學(xué)研究應(yīng)用中扮演著重要的角色。2009年Kelly Virkler等[9]利用拉曼光譜測(cè)量比較了50例精液樣品的拉曼光譜信號(hào)。分析比較發(fā)現(xiàn)不同的精液樣品總體的拉曼譜峰、輪廓基本一致，樣品間總體光譜輪廓上無明顯差異。進(jìn)一步通過顯著因子分析法(SFA)和交替最小二乘法(ALS)的分析處理,發(fā)現(xiàn)干燥的精液主要包含酪氨酸，蛋白、膽堿及精胺等三個(gè)主要光譜成分。結(jié)合精液中主要物質(zhì)的光譜特征峰對(duì)總體的平均譜進(jìn)行擬合分析，以及擬合優(yōu)度指標(biāo)評(píng)估特征性數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)光譜的匹配度，發(fā)現(xiàn)精液拉曼光譜具有明顯區(qū)別于血液和唾液拉曼光譜的特征，結(jié)合這些主要成分的光譜數(shù)據(jù)有望用于犯罪現(xiàn)場(chǎng)精液的確認(rèn)與其他不同體液的區(qū)分。

法醫(yī)學(xué)中犯罪現(xiàn)場(chǎng)的體液鑒別檢測(cè)往往情況復(fù)雜，其中精液和血液的混合更為常見，因而容易對(duì)原本就痕量的精液檢測(cè)結(jié)果造成嚴(yán)重干擾，2012年Vitali Sikirzhytski等[10]首先分別測(cè)量了血液、精液純樣品的拉曼光譜，并測(cè)量獲得兩者不同比例混合的拉曼光譜數(shù)據(jù)，結(jié)合SVMDA方法(支持矢量機(jī)判別)針對(duì)不同比例混合的精液、血液樣品進(jìn)行鑒別區(qū)分。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，結(jié)合光譜數(shù)據(jù)分析處理，拉曼光譜檢測(cè)方法可實(shí)現(xiàn)混合物中精液含量5%(甚至更低)的檢測(cè)限，雖然結(jié)果的可靠性有待真實(shí)犯罪現(xiàn)場(chǎng)的進(jìn)一步驗(yàn)證，但初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出該方法有望推廣應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)中犯罪現(xiàn)場(chǎng)的精液檢測(cè)，以及各種混雜體液的鑒別區(qū)分。

2 精液拉曼光譜在男性生殖生育方面的研究

2.1 精漿的拉曼光譜研究

精漿不僅是精子運(yùn)輸?shù)妮d體，更是精子生長(zhǎng)發(fā)育的“土壤”，因而精漿生化指標(biāo)的檢測(cè)對(duì)于精液、精子質(zhì)量的評(píng)估，以及男性生育能力的診斷具有重要的指導(dǎo)意義。精漿中所含的果糖，檸檬酸等物質(zhì)的測(cè)定可間接反映出精液中精子的活力和質(zhì)量，成為男性生殖生育領(lǐng)域研究關(guān)注的熱點(diǎn)。目前臨床關(guān)于精漿中某種特定物質(zhì)的生化檢測(cè)已有成熟的試劑盒，然而這些測(cè)試存在操作繁瑣、耗時(shí)、需專門技術(shù)人員等問題。尋找操作簡(jiǎn)便、快速的測(cè)量方法具有十分重要的意義。為此，作者本人首次結(jié)合精漿樣品預(yù)處理和拉曼光譜方法開展精漿中檸檬酸的定量檢測(cè)；即首先將精液樣品進(jìn)行離心獲得精漿，然后采用截止蛋白為3 kDa的濾膜進(jìn)一步過濾精漿中的大蛋白分子等，進(jìn)而獲得精漿超濾液；之后通過設(shè)置適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)功率進(jìn)行精漿超濾液的拉曼光譜采集，通過記錄檸檬酸的952 cm-1拉曼特征峰的強(qiáng)度值，并與檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)試劑盒定量測(cè)量值進(jìn)行比較，獲得檢測(cè)限為1.0 mg·mL-1的檢測(cè)結(jié)果[11]。初步研究結(jié)果表明，在檢測(cè)精度要求不高的前提下，該方法有望為精液中檸檬酸含量的定量提供檢測(cè)新方法。此外，我們采用液滴涂層沉積拉曼(drop coating deposition Raman, DCDR)光譜技術(shù)針對(duì)精漿中的果糖開展定量檢測(cè)研究，實(shí)驗(yàn)中利用“咖啡環(huán)效應(yīng)”現(xiàn)象實(shí)現(xiàn)精漿濾液中果糖的富集，結(jié)合果糖的627cm-1特征峰，以標(biāo)準(zhǔn)濃度的果糖溶液為參考，通過強(qiáng)度比值獲得精漿中果糖含量的定量檢測(cè)，將拉曼方法的檢測(cè)結(jié)果與果糖標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)試劑盒的定量檢測(cè)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，該方法的檢測(cè)相對(duì)誤差為10.23%[12]，雖實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有待于進(jìn)一步的優(yōu)化和提高，初步實(shí)驗(yàn)表明相比于果糖試劑盒檢測(cè)方法，該方法具備操作快速、測(cè)量簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。

男性不育往往是多因素共同作用的結(jié)果，針對(duì)單一成分的測(cè)定可能不足以客觀、全面的評(píng)估男性生育能力。采用拉曼光譜技術(shù)針對(duì)精漿整體進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估，可獲得精漿中各種物質(zhì)成分的綜合拉曼光譜，有望為精漿質(zhì)量評(píng)估提供全面、客觀的數(shù)據(jù)信息。2011年本課題組利用拉曼技術(shù)測(cè)量精液中分離了精子后的精漿拉曼光譜，分析比較了正常和異常精液所對(duì)應(yīng)的精漿的拉曼光譜；雖然兩者在拉曼譜形上無明顯的差異(如圖1所示)，通過差譜比較可明顯發(fā)現(xiàn)歸屬于色氨基酸的1 449 cm-1譜峰與歸屬于脂質(zhì)的1 418 cm-1譜峰存在著顯著差異，結(jié)合主成分分析和線性判別分析法可獲得較好的區(qū)分[13]。

圖1 正常和異常精漿光譜比較

此外，我們還利用了偏振-表面增強(qiáng)拉曼光譜的方法分析比較正常和異常精液的精漿偏振SERS光譜，相比于常規(guī)拉曼光譜，精漿SERS光譜具有很好的信噪比，豐富的譜峰信息。實(shí)驗(yàn)中我們對(duì)比正常，左旋和右旋圓偏振光激發(fā)下正常和異常精液中的精漿SERS光譜的差異(如圖2所示)，同樣結(jié)合主成分分析等數(shù)據(jù)分析方法，對(duì)獲得的精漿SERS光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在左旋偏振激發(fā)下可獲得很好的區(qū)分[14]。

圖2 不同偏振激發(fā)下的精漿SERS光譜比較，詳見參考文獻(xiàn)[14]

Fig.2 Comparison of SERS spectra from seminal plasma under different types of excitation, see Ref.[14] for detail

2.2 精子的拉曼光譜研究

精子是男性的生殖細(xì)胞，在男性生殖生育領(lǐng)域中精子形態(tài)是評(píng)估其質(zhì)量的重要特征之一，研究表明不育男性精液中異常形態(tài)精子所占比例高，即使正常健康的個(gè)體，精液中形態(tài)異常精子約占精子總數(shù)的25%～40%。形態(tài)異常往往意味著功能異常，且精子形態(tài)異常與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常有關(guān)[15-17]?；谄胀ü鈱W(xué)顯微鏡的精子形態(tài)統(tǒng)計(jì)分析操作簡(jiǎn)便，但重復(fù)性和準(zhǔn)確性不佳；高分辨成像法，如電鏡技術(shù)，X射線成像，二次離子質(zhì)譜儀等雖可實(shí)現(xiàn)精子高分辨率的結(jié)構(gòu)成像分析，但存在樣品制備要求高、測(cè)量時(shí)間長(zhǎng)等問題；此外基于精子涂片的染色技術(shù)，如Diff-quick染色、瑞士-姬姆薩染色、巴氏染色等，雖可提供簡(jiǎn)單有效的精子形態(tài)染色評(píng)估，由于對(duì)精子樣品的有損操作性，因而不具備應(yīng)用于活體精子評(píng)估分析的可能。針對(duì)這些問題，Meister等提出采用顯微拉曼光譜方法進(jìn)行單個(gè)精子的刻畫，即利用拉曼光譜成像的方法對(duì)精子進(jìn)行整體的刻畫，結(jié)合聚類分析方法，成功實(shí)現(xiàn)精子不同部位(頭部，頸部，中段線粒體，尾部)的拉曼光譜成像，并初步評(píng)估不同劑量紫外光對(duì)精子細(xì)胞核、線粒體等部位的影響[18]，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一定劑量的紫外光照射雖然對(duì)精子形態(tài)影響不大，但拉曼光譜中來源于線粒體的751 cm-1和來源于精子細(xì)胞核的788 cm-1兩個(gè)譜峰發(fā)生明顯的變化，結(jié)果表明基于顯微拉曼光譜的精子評(píng)估，可無損獲得單個(gè)精子的生化信息，為今后開展精子的無損、快速評(píng)估提供前期的可行性研究。Victoria等[19]以流式細(xì)胞計(jì)的精子DNA損傷分析結(jié)果作為參考，對(duì)200個(gè)精子的DNA進(jìn)行拉曼光譜測(cè)量，將得到的拉曼光譜數(shù)據(jù)與流式細(xì)胞計(jì)的分析結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，拉曼譜峰中同樣歸屬于DNA磷酸骨架的1 050和1 095 cm-1譜峰的強(qiáng)度比值(1 050/1 095)與精子DNA碎片指數(shù)成正比(如圖3所示)。

圖3 DNA碎片指數(shù)為27%的未處理精子拉曼光譜(黑色)和碎片指數(shù)為92%的氧化損傷精子拉曼光譜(紅色)的比較，詳見參考文獻(xiàn)[20]

Fig.3 Raman spectra of an untreated spermatozoon with 27% DFI (black) and of another after induced oxidative nDNA damage resulting in 92% DFI (red), see Ref.[20] for detail

即兩個(gè)譜峰的比值越高，精子DNA損傷越嚴(yán)重，實(shí)驗(yàn)初步結(jié)果顯示1 050和1 095 cm-1兩個(gè)拉曼譜峰的比值有望作為拉曼光譜評(píng)估精子DNA損傷情況的無損、客觀新標(biāo)準(zhǔn)。2013年，上海仁濟(jì)醫(yī)院Feng Liu等[20]比較了卵子透明帶結(jié)合及未結(jié)合精子時(shí)的實(shí)時(shí)拉曼光譜，發(fā)現(xiàn)在800～900和3 200～4 000 cm-1兩個(gè)波數(shù)范圍內(nèi)兩者存在一定的強(qiáng)度差異，雖然測(cè)量獲得的拉曼光譜的整體信噪比較低，結(jié)果提示該方法有望將來用于鑒別區(qū)分透明帶結(jié)合和未結(jié)合的精子。2014年，我們小組提出結(jié)合圖像處理與拉曼光譜分析的方法，初步獲得確保形態(tài)和質(zhì)量客觀評(píng)估的正常精子的快速鑒別和篩選，有望用于今后臨床開展的單精子水平的精子質(zhì)量快速和客觀評(píng)估[21]。

基于拉曼光譜的精子質(zhì)量刻畫和分析主要仍局限于非活動(dòng)精子的測(cè)量，直接開展基于拉曼光譜檢測(cè)的活動(dòng)精子質(zhì)量的評(píng)估還未見報(bào)道。為此我們小組初步開展了體外活動(dòng)精子的顯微拉曼光譜檢測(cè)，通過與非活動(dòng)精子的拉曼光譜的比較，發(fā)現(xiàn)兩者的光譜整體差異較??；此外，實(shí)驗(yàn)還初步獲得“正?！本訉?duì)應(yīng)的特征拉曼光譜數(shù)據(jù)和評(píng)價(jià)指標(biāo)，特別在活動(dòng)精子的拉曼光譜中初步驗(yàn)證了譜峰中歸屬于磷酸骨架的1 050和1 095 cm-1的譜峰比值與精子DNA質(zhì)量高度相關(guān)。初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基于顯微拉曼系統(tǒng)的活體精子的拉曼光譜評(píng)估方法有望服務(wù)于生殖領(lǐng)域中優(yōu)質(zhì)活體精子的無損評(píng)估和篩選，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還在完善和統(tǒng)計(jì)中。

3 結(jié) 論

拉曼光譜技術(shù)擁有其他光譜技術(shù)無法兼具的非標(biāo)記、無損性、特異性高等綜合優(yōu)勢(shì)，因而其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究備受關(guān)注。不論是犯罪現(xiàn)場(chǎng)的精液痕量檢測(cè)鑒別，還是基于精液的男性生育能力的評(píng)估，拉曼光譜技術(shù)在這些領(lǐng)域的前期基礎(chǔ)研究已顯示出充分的可行性。應(yīng)該指出的是，拉曼光譜技術(shù)在人體精液方面的研究還屬于初步階段，如在法醫(yī)學(xué)鑒定應(yīng)用領(lǐng)域還無法與現(xiàn)有的常規(guī)分析和DNA分析等手段相競(jìng)爭(zhēng)，還有待于大量基礎(chǔ)性及臨床性的研究和驗(yàn)證工作的開展。拉曼光譜技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，如便攜式拉曼光譜儀的普及與應(yīng)用，高性能SERS基底的發(fā)展，以及拉曼光譜數(shù)據(jù)分析方法的優(yōu)化，必將深化和發(fā)展法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和男性生殖生育領(lǐng)域中精液的研究，同時(shí)有望將這些研究方法推廣應(yīng)用于女性的生殖生育研究領(lǐng)域，進(jìn)而為人類的生殖生育診斷評(píng)估提供簡(jiǎn)便、可靠的新方法，更好的造福人類。

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(Received Jun.11, 2015; accepted Nov.5, 2015)

*Corresponding author

Studies of Male Fertility with Raman Spectroscopy

HUANG Zu-fang1*, CAO Gang1, SUN Yan2, DU Sheng-rong2, LI Yong-zeng1, LIN Ju-qiang1, FENG Shang-yuan1,LEI Jin-ping1

1.Key Laboratory of OptoElectronic Science and Technology for Medicine of Ministry of Education, Fujian Provincial Key Laboratory of Photonics Technology, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China 2.Fujian Maternal and Child Health Hospital, Fuzhou 350001, China

Raman spectroscopy which belongs to scattering spectroscopy obtained molecular vibrational and rotational information to achieve detection and analysis of molecular structure and corresponding changes through recording the frequency shift when light interacted with materials.Compared with routine biochemical analysis, Raman spectroscopy has the advantage of non-invasive, label-free and no sample requirement.Raman spectroscopy has been widely applied in biomedical field such as human tissue, organs, cells and human body fluids for disease diagnosis.This article mainly focuses on recent research advances of Raman spectroscopy in human semen.Firstly, Raman spectroscopy(including surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS) employed in forensic science for semen analysis, and some related data processing methods were introduced, then Raman spectroscopy involved investigations of male fertility was highlighted, more specifically, the Raman-based qualitative and quantitative analysis which assist the objective detection and evaluation of male fertility.Furthermore, studies of single sperm cell based on micro-Raman system to characterize and evaluate sperm quality and the preliminarily obtained Raman biomarkers which indicate high-quality sperm cell were introduced.Finally, the potential development of Raman spectroscopy involved in reproduction and fertility field was also discussed.

Spermatozoa; Seminal plasma; Raman spectroscopy; Surface-enhanced Raman spectroscopy; Diagnosis; Quantitative analysis

2015-06-11，

2015-11-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(61308113, 61210016，11274065)，福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013J01225)，教育部“長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃” 創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目滾動(dòng)支持計(jì)劃項(xiàng)目(IRT_15R10)資助

黃祖芳，1981年生，福建師范大學(xué)助理研究員 e-mail: zfhuang@fjnu.edu.cn *通訊聯(lián)系人 e-mail: zfhuang@fjnu.edu.cn

Q492

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)09-2818-05