孫鵬，谷靜逸，尹海波，張建逵，賈曉晴，邵飛

（1.沈陽(yáng)市第七人民醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110003；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

老鸛草，始見(jiàn)于明代蘭茂的《滇南本草》[1]，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，來(lái)源于牻牛兒苗科植物牻牛兒苗(Erodiumstephanianum Willd)、老鸛草(Geranium wilfordii Maxim)或野老鸛草(G carolinianumL)的干燥地上部分，收載于我國(guó)2015年版《藥典》[2]。我國(guó)有牻牛兒苗科植物4屬，約67種，其中老鸛草屬植物55種[3]，其中分布于遼寧省的有7種，分別為老鸛草(Geranium wilfordii Maxim)、鼠掌老鸛草(Geranium sibiricum L)、塊根老鸛草(Geranium dahuricum DC)、突節(jié)老鸛草 (Geranium Krameri Franch.et Sav Enum)、朝鮮老鸛草(Geranium franchetii R.Kunth)、長(zhǎng)白老鸛草(Geranium baishanense Y.L.Chang)和毛蕊老鸛草(Geranium eriostemon Fish.ex DC)[3-5]。本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，揭示了遼寧省老鸛草屬植物資源的親緣關(guān)系及群體間的遺傳多樣性。

1 材料

供試材料均于2014和2015年7-9月采自遼寧省東部山區(qū)的21個(gè)居群，均經(jīng)大連自然博物館張淑梅教授和遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室尹海波教授鑒定,具體信息見(jiàn)表1。

表1 樣品基本信息

2 方法

2.1 DNA提取

將存儲(chǔ)在-80℃冰箱內(nèi)的實(shí)驗(yàn)材料取出，迅速置于研缽中充分研磨。按照TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行DNA的提取，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，各個(gè)電泳道均出現(xiàn)一條清晰的DNA條帶，即所提取的DNA均完整。

2.2 ISSR引物的選擇

本實(shí)驗(yàn)所用ISSR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，源自University of British Columbia（UBC大學(xué)）公布的100條ISSR引物。根據(jù)相關(guān)論文[6]，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)材料，從中篩選出擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、多態(tài)性較好的引物用于不同種老鸛草親緣關(guān)系的分析。

2.3 老鸛草屬植物ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系的建立

PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化是ISSR技術(shù)獲得較好研究結(jié)果的先決條件[7]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)退火溫度、引物濃度和DNA模板量進(jìn)行優(yōu)化，建立了PCR的最佳反應(yīng)體系。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（上海Sangon）染色，于Syngene凝膠成像儀觀察并拍照。

2.4 數(shù)據(jù)處理

ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，將電泳圖譜中較清晰的條帶（包括弱帶）計(jì)為“1”，無(wú)帶計(jì)為“0”，利用POPGENE軟件計(jì)算等位基因數(shù)、Nei′s遺傳多樣性指數(shù)、Shannona信息多樣性指數(shù)等參數(shù)；利用軟件NTsys 2.10e分析遺傳相似性系數(shù)，按UPGMA法構(gòu)建聚類(lèi)圖[8，9]。

3 結(jié)果與分析

3.1 老鸛草屬植物的遺傳多樣性

3.1.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

采用24條隨機(jī)引物對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增篩選，其中8條引物能擴(kuò)增出帶形清晰、多態(tài)性較好、清晰度高的擴(kuò)增產(chǎn)物(表2)，擴(kuò)增條帶分布在300～3 000 bp之間(圖1)。8條引物共擴(kuò)增出149條條帶，其中多態(tài)性條帶146條，多態(tài)性比率為97.99%，揭示老鸛草屬植物在物種水平上保持相當(dāng)高的遺傳多樣性。

表2 ISSR-PCR的擴(kuò)增結(jié)果

3.1.2 Shannon信息指數(shù)分析和Nei遺傳多樣性指數(shù)分析

利用Popgene 32軟件對(duì)7種老鸛草居群進(jìn)行遺傳多樣性分析。由表3可以看出，老鸛草各個(gè)種群的平均Shannon指數(shù)和Nei′s基因多樣性指數(shù)分別在 0.236 4～0.402 9（平均 0.311 1）和 0.140 2～0.267 5（平均0.206 6）范圍內(nèi)，表明老鸛草屬植物種群間具有較高的多態(tài)性、遺傳變異和進(jìn)化水平。7個(gè)種群中，遺傳變異水平大小為PopK＞PopB＞PopM＞PopT＞PopS＞PopL＞PopC[10-12]。

3.1.3 老鸛草的遺傳結(jié)構(gòu)

圖1 部分UBC引物對(duì)7種老鸛草樣品的ISSR擴(kuò)增結(jié)果 （M為標(biāo)準(zhǔn)分子量DL 5 000）

遺傳結(jié)構(gòu)是通過(guò)物種居群內(nèi)和居群間的遺傳分化來(lái)體現(xiàn)的，根據(jù)總的遺傳多樣性（Ht）和群體內(nèi)遺傳多樣性（Hs）計(jì)算不同種群間的遺傳多樣性（Dst,Dst=Ht-Hs）和遺傳分化水平（Gst,Gst=Dst/Ht）。7個(gè)老鸛草種群間的遺傳多樣性Dst=0.250 5，分化指數(shù)Gst=0.604 2，說(shuō)明種群間的遺傳變異占60.42%，而種群內(nèi)的遺傳變異為39.58%，雖然種群間變異占主要比重，但種群內(nèi)的變異程度亦相當(dāng)大；基因流系數(shù)Nm為0.327 7，遠(yuǎn)小于1，說(shuō)明種群間存在明顯的分化[13、14]。

3.2 老鸛草屬植物種間親緣關(guān)系分析

利用Ntsys 2.10 e軟件計(jì)算7個(gè)種間的遺傳相似系數(shù)；采用UPGMA聚類(lèi)分析方法構(gòu)建親緣關(guān)系樹(shù)狀聚類(lèi)圖（圖2）。結(jié)果顯示，7種老鸛草在相似系數(shù)為0.52處被聚為兩類(lèi)，老鸛草和鼠掌老鸛草被聚為Ⅰ類(lèi)，其他5種聚為Ⅱ類(lèi)；在相似系數(shù)為0.55處，Ⅱ類(lèi)又分為3個(gè)亞類(lèi)，即塊根老鸛草、突節(jié)老鸛草和長(zhǎng)白老鸛草為一類(lèi)，朝鮮老鸛草和毛蕊老鸛草各為一類(lèi)，其中，塊根老鸛草和突節(jié)老鸛草的親緣關(guān)系最為接近，相似系數(shù)高達(dá)0.77。該分類(lèi)結(jié)果與《中國(guó)植物志》中對(duì)組劃分及對(duì)原植物形態(tài)的分類(lèi)結(jié)果相一致。

4 討論

4.1 對(duì)遼寧省老鸛草屬植物的考證

據(jù)《中國(guó)植物志》記載，北方老鸛草（Geranium erianthum DC.）產(chǎn)于吉林省東部；《東北草本植物志》收錄老鸛草屬植物共9種，其中分布于遼寧的有6種，另記載北方老鸛草在吉林省多個(gè)縣均有分布；《遼寧植物志》共收載老鸛草屬植物7種，亦未將毛蕊老鸛草（Geranium eriostemon Fish.ex DC.）列入其中，而將Geranium erianthum DC.收錄。本實(shí)驗(yàn)取材主要基于以下兩點(diǎn)考證：一是就現(xiàn)有資料來(lái)看，《中國(guó)植物志》第43卷成書(shū)于1997年，《東北草本植物志》第6卷成書(shū)于1977年，《遼寧植物志》成書(shū)于1988年。因此筆者推測(cè)，《東北草本植物志》對(duì)遼寧省僅有6種的記載實(shí)為紕漏，成書(shū)最晚的《中國(guó)植物志》明確收載于《遼寧植物志》的Geranium erianthum DC.一種產(chǎn)于吉林省，該說(shuō)法與《東北草本植物志》的信息一致，而Geranium erianthum DC.和Geranium eriostemon Fish.ex DC.在親緣關(guān)系上極為相近[10]，因此，初步判斷《遼寧植物志》對(duì)Geranium erianthum DC.很可能為誤定。二是在實(shí)地考察中，2014，2015年6-9月間我們?cè)谶|寧省調(diào)查了近200個(gè)天然山區(qū)，其中包括《遼寧植物志》中對(duì)Geranium erianthum DC.有收錄的桓仁、寬甸等山區(qū)，并未發(fā)現(xiàn)Geranium erianthum DC.，而Geranium eriostemon Fish.ex DC.在遼寧山區(qū)尤其本溪縣內(nèi)普遍分布較多；后又考察了中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)生態(tài)所（中國(guó)科學(xué)院林業(yè)土壤研究所前身）的憑證標(biāo)本，該標(biāo)本現(xiàn)無(wú)根部、無(wú)花果部位，唯有3大3小葉片存留，雖葉裂均至3/4處，但就目前不完整的信息并不能排除是Geranium eriostemon Fish.ex DC.的可能性。此外，我們?cè)谠撍鵊eranium erianthum DC.標(biāo)本的標(biāo)注地區(qū)桓仁老禿頂多次進(jìn)行較大規(guī)模的考察，依然未能發(fā)現(xiàn)該種，其中同行的有大連自然博物館張淑梅教授。綜合以上兩點(diǎn)的考證，筆者可初步斷定遼寧省的老鸛草屬植物共7種，分 別 為 GeraniumwilfordiiMaxim.、Geranium sibiricum L.、Geranium eranim dahuricum DC.、Geranium krameri Franch.et Sav.Enum.、Geranium koreanum Kom.in Act.、Geranium paishanense Y.L.Chang.和Geranium eriostemon Fish.ex DC.，而更正了《遼寧植物志》中的Geranium erianthum DC.。

表3 195份老鸛草樣品遺傳多樣性的ISSR分析

表4 7個(gè)種間的Nei遺傳距離（斜對(duì)線上方）和相似系數(shù)（斜對(duì)線下方）

圖2 7種老鸛草基于ISSR的遺傳相似性UPGMA聚類(lèi)圖

4.2 ISSR在老鸛草屬植物種間親緣關(guān)系分析的適用性

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)能在不同的物種間通用，具有操作簡(jiǎn)單、成本較低、穩(wěn)定性高、模板DNA用量少、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)。采用該法對(duì)同屬不同種間親緣關(guān)系的分析屢見(jiàn)不鮮，而目前在老鸛草屬植物中利用ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行種間親緣關(guān)系的分析尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用ISSR引物的通用性特點(diǎn)，將該分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于遼寧省老鸛草屬植物親緣關(guān)系的考察。結(jié)果表明，該標(biāo)記技術(shù)在反映老鸛草屬植物資源間的親緣關(guān)系和群體間遺傳多樣性中可行。由聚類(lèi)結(jié)果可知，Ⅰ類(lèi)均為直根系，Ⅱ類(lèi)均為塊根，在Ⅱ類(lèi)下依次分出處于高寒地區(qū)的毛蕊老鸛草、朝鮮老鸛草和長(zhǎng)白老鸛草，生長(zhǎng)于草甸的塊根老鸛草和突節(jié)老鸛草的親緣關(guān)系最為接近，該結(jié)果與原植物形態(tài)、分布地區(qū)的記載完全吻合，也表明老鸛草屬植物資源的遺傳分化與其來(lái)源的生態(tài)環(huán)境相關(guān)聯(lián)。

4.3 老鸛草屬植物的遺傳多樣性

本研究中，8條ISSR引物的多態(tài)性為97.99%，表明該7個(gè)種群間具有相當(dāng)豐富的遺傳多樣性。遺傳變異水平大小順序?yàn)閴K根老鸛草＞長(zhǎng)白老鸛草＞毛蕊老鸛草＞突節(jié)老鸛草＞鼠掌老鸛草＞老鸛草＞朝鮮老鸛草，且塊根老鸛草種群的Nei＇s基因多樣性（0.290 7）遠(yuǎn)高于其他6個(gè)種群的平均水平（0.143 0）。照原植物形態(tài)來(lái)講，塊根老鸛草和大花組（直徑D＞2.0 cm）中的突節(jié)老鸛草極為相似，本研究亦證實(shí)二者的親緣關(guān)系最為接近，但塊根老鸛草卻與Ⅰ類(lèi)中的老鸛草和鼠掌老鸛草同歸為小花組（直徑D＜2.0 cm），筆者猜測(cè)形態(tài)上的交叉可能是源于塊根老鸛草豐富的遺傳多樣性；長(zhǎng)白老鸛草雖多處環(huán)境較單一的高寒地區(qū)，其遺傳變異水平卻僅次于塊根老鸛草，該結(jié)果恰恰證實(shí)了《中國(guó)植物志》中長(zhǎng)白老鸛草是塊根老鸛草原變種高寒類(lèi)型的觀點(diǎn)。

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