王 爽 張毅強(qiáng) 蘭曉瑜 程牛亮 李美寧（山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西 太原 030001）

?

設(shè)計(jì)VEGF的G四鏈體誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的研究

王 爽 張毅強(qiáng) 蘭曉瑜 程牛亮 李美寧*
（山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西 太原 030001）

【摘要】目的 pu22寡核苷酸序列作用于VEGF基因使VEGF啟動(dòng)子區(qū)形成G-四鏈體，干擾VEGF基因的表達(dá)從而促進(jìn)HCT116細(xì)胞和SW480細(xì)胞的凋亡。方法 設(shè)計(jì)合成的pu22和mutpu22攝取到細(xì)胞后，在pu22不同濃度作用下，通過實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測VEGF基因的表達(dá)情況，利用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測VEGF蛋白表達(dá)水平；通過細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測兩種結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果 熒光實(shí)時(shí)定量PCR與免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示處理組的兩種結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116與SW480用8 μL/L的PU22處理48 h后VEGF的表達(dá)最低，其相對(duì)表達(dá)值均顯著低于正常細(xì)胞組及空白對(duì)照組。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種細(xì)胞處理組凋亡率均大于相應(yīng)的正常組與對(duì)照組。結(jié)論 寡核苷酸序列PU22對(duì)殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞起著顯著的作用。

【關(guān)鍵詞】VEGF；G-四鏈體；pu22

結(jié)直腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一。抑制血管生成是阻遏腫瘤生長的一種策略，Vegf是控制血管生成的主要基因之一。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了針對(duì)VEGF啟動(dòng)子區(qū)域的G四鏈體PU22，在結(jié)腸癌細(xì)胞攝取PU22后檢測VEGF基因RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，分析細(xì)胞增殖和凋亡的情況，從而探討PU22對(duì)VEGF基因表達(dá)的影響與結(jié)腸癌增殖與凋亡的關(guān)系，研究PU22對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的影響。為尋找結(jié)腸癌新藥的研發(fā)和治療方法奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 PU22與mutPU22：PU22序列5'-CGGGGCGGGCCGGGGGCGGGG T-3'［1-5］，mutPU22序列5'-CGAGTCGCGCCGAGTGCGAGAT-3'。人工合成的PU22與mutPU22用培養(yǎng)基溶解，95 ℃煮沸5 min，-20 ℃保存。

1.2 分析細(xì)胞攝取寡核苷酸PU22實(shí)驗(yàn)：用8 mmol/L帶有FITC熒光的PU22作用已經(jīng)爬好片的細(xì)胞中，培養(yǎng)72 h后取出去上清，依次進(jìn)行固定，染色，封片，照相，結(jié)果分析。

1.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析：用TriZol法提取經(jīng)不同處理的細(xì)胞總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成CDNA，進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。

圖1 2種細(xì)胞攝取PU22的情況

圖2 實(shí)時(shí)定量檢測PU22作用前后結(jié)腸癌細(xì)胞VEGF基因RNA表達(dá)情況

圖3 Western blotting檢測經(jīng)不同條件作用后結(jié)腸癌細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)情況

圖4 PU22作用48 h后結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡情況

1.4 western blotting分析：不同處理的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。后測量蛋白濃度。將所提的蛋白依次進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、免疫學(xué)反應(yīng)、顯影與結(jié)果分析。

1.5 流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞凋亡：通過PU22作用后的細(xì)胞去培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，過濾細(xì)胞，1000rpm離心5 min，去多余上清，混勻細(xì)胞，5 μL Annexin V-FITC和10 μL 20 μg/mL的碘化丙錠溶液，混勻后室溫避光孵育20 min，加250 μL PBS，流式細(xì)胞儀分析。

2 結(jié) 果

2.1 人工合成的PU22被攝入人結(jié)腸癌細(xì)胞中：見圖1顯示，圖1中藍(lán)色熒光為細(xì)胞核所在的位置。用帶有綠色熒光標(biāo)記的PU22處理細(xì)胞72 h后觀察結(jié)果。結(jié)果表明HCT116和SW480細(xì)胞內(nèi)可觀察到綠色熒光，且攝取率為90%以上。說明細(xì)胞可以高效地?cái)z取寡核苷酸PU22。

2.2 PU22抑制結(jié)腸癌細(xì)胞VEGF基因RNA表達(dá)：PU22作用后結(jié)腸癌細(xì)胞中VEGF的RNA表達(dá)情況，用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測。本實(shí)驗(yàn)分為正常組（細(xì)胞未經(jīng)過處理）、mut組（細(xì)胞用mutPU22處理）、6 μL/L組（細(xì)胞用6 μL/L PU22處理）、8 μL/L組（細(xì)胞用8 μL/L PU22處理）、10 μL/L組（細(xì)胞用10 μL/L PU22處理）。將正常組細(xì)胞的VEGF的RNA表達(dá)量設(shè)為1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和SW480經(jīng)不同濃度PU22作用后細(xì)胞中VEGF基因RNA的表達(dá)量皆有降低，其中作用最明顯的濃度為8 μL/L，最佳時(shí)間為48 h。而經(jīng)mutPU22作用的細(xì)胞中VEGF基因RNA的表達(dá)無明顯變化，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見圖2。

2.3 PU22抑制結(jié)腸癌細(xì)胞VEGF基因蛋白表達(dá)比較：PU22作用后結(jié)腸癌細(xì)胞中VEGF的蛋白表達(dá)情況用Western blotting技術(shù)檢測。本實(shí)驗(yàn)將8 μL/L PU22處理過細(xì)胞設(shè)為處理組；未經(jīng)處理過的細(xì)胞設(shè)為正常組；用mutPU22處理過的細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組。結(jié)果表明人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和SW480經(jīng)不同條件作用后，細(xì)胞中VEGF蛋白的表達(dá)量皆有降低，且皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。48 h SW480蛋白表達(dá)量降低最顯著。見圖3。

2.4 PU22作用48 h后促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡：Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞在不同條件下處理48 h后細(xì)胞凋亡情況。見圖4顯示，HCT116細(xì)胞的處理組、正常組、對(duì)照組，其細(xì)胞凋亡率分別為42.46%、11.06%、28.78%。其中處理組細(xì)胞凋亡率大于正常組和對(duì)照組。SW480細(xì)胞的處理組、正常組、對(duì)照組，其細(xì)胞凋亡率分別為69.14%、14.31%、32.95%。其中處理組細(xì)胞凋亡率大于正常組和對(duì)照組。結(jié)果表明PU22促進(jìn)HCT116與SW480細(xì)胞凋亡。

3 討 論

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。在世界癌癥研究基金會(huì)報(bào)告（WCRF/AICR 2007）［6］中，大腸癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第3位，其病死率在全世界排名第2位［7］。因此結(jié)腸癌的治療方法的研究已成為腫瘤研究的重要課題。

VEGF是癌癥中強(qiáng)效的促進(jìn)血管生長因子，腫瘤細(xì)胞通過VEGF誘導(dǎo)血管生成，使其提供充分的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)［8］。近年來通過抑制VEGF從而達(dá)到殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞的研究很多，如節(jié)律卡培他濱也是通過調(diào)節(jié)VEGF基因從而達(dá)到抗腫瘤的作用［9］。然而節(jié)律卡培他濱作用人體時(shí)易產(chǎn)生骨髓抑制、消化系統(tǒng)反應(yīng)和手足綜合征等不良反應(yīng)。G-四鏈體是一種指依靠鳥嘌呤連接起來的四鏈DNA螺旋結(jié)構(gòu)。由于癌細(xì)胞分裂非常迅速，染色體容易出現(xiàn)缺失，所以G-四鏈體分子可能唯一存在于癌細(xì)胞中。如果這樣的話，G-四鏈體的任何癌癥治療都不會(huì)傷害健康細(xì)胞，這為癌癥治療開起了的新的研究與治療的方向。

VEGF等幾種癌癥相關(guān)基因的啟動(dòng)子內(nèi)含有一個(gè)能夠形成G-四鏈體的核酸酶超敏感區(qū)域［11］。我們研究顯示，體外寡核苷酸鏈形成的G-四鏈體也可以下調(diào)VEGF基因，從而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。確定結(jié)腸癌細(xì)胞攝取PU22寡核苷酸后，我們研究發(fā)現(xiàn)，用PU22處理過的SW480和HCT116細(xì)胞，其RNA與蛋白表達(dá)量皆低于正常組與對(duì)照組，且最佳濃度為8 μL/L最佳作用時(shí)間為48 h，HCT116細(xì)胞VEGF基因的抑制率低于SW480細(xì)胞，出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能由于PU22濃度過高或作用時(shí)間長從而誘導(dǎo)細(xì)胞分泌大量的解G-四鏈體的解旋酶，HCT116細(xì)胞的惡性程度比SW480高等原因產(chǎn)生的。PU22作用SW480和HCT116細(xì)胞48 h后，兩種細(xì)胞處理組凋亡率皆大于相應(yīng)的正常組與對(duì)照組。表明PU22可以通過抑制VEGF基因，達(dá)到提高細(xì)胞凋亡的作用。

本研究是將體外合成的寡核苷酸PU22形成的G-四鏈體攝入結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)VEGF基因的啟動(dòng)子中PU22序列形成G-四鏈體，抑制VEGF基因的表達(dá)，從而促使結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長與增殖。綜上所述，本研究可以選擇性的殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞，為治療結(jié)腸癌帶來了一個(gè)新希望。本實(shí)驗(yàn)為結(jié)腸癌新藥材的研發(fā)和治療提供了新的手段。

參考文獻(xiàn)

［1］Agrawal P，Hatzakis E，Guo K，et al.Solution structure of the major G-quadruplex formed in the human VEGF promoter in K+: insights into loop interactions of the parallel G-quadruplexes［J］. Nucleic Acids Res，2013，41（22）:10584-10592.

［2］Sun D，Guo K，Rusche JJ，et al.Facilitation of a structural transition in the polypurine/polypyrimidine tract within the proximal promoter region of the human VEGF gene by the presence of potassium and G-quadruplex-interactive agents［J］.Nucleic Acids Res，2005，33（18）: 6070-6080.

［3］Sun D，Guo K，Shin YJ.Evidence of the formation of G-quadruplex structures in the promoter region of the human vascular endothelial growth factor gene［J］.Nucleic Acids Res，2011，39（4）:1256-1265.

［4］Biff1 G，Tannahill D，Balasubramanian S.Quantitative visualization of DNA G-quadruplex structures in human cells［J］.Nat Chemistry，2013，5（3）:182-186.

［5］Marusic M，Rakesh NV，Wengel J，et al.G-rich VEGF aptamer with locked and unlocked nucleic acid modifcations exhibits a unique G-quadruplex fold［J］.Nucleic Acids Res，2013，41（20）:9524-9536.

［6］Wiseman M.The second World Cancer Research Fund/American Institute for Cancer Research expert report.Food，nutrition，physical activity，and the prevention of cancer:a global perspective［J］.Proc Nutr Soc，2008，67（3）:253-256.

［7］Siegel R，Ward E，Brawley O，et al.Cancer statistics，2011:The impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（4）:212-236.

［8］Carmeliet P.VEGF as a key mediator of angiogenesis in cancer［J］. Oncology，2005，69（3）:4-10.

［9］Rak J，Mitsuhashi Y，Bayko L.Mutant ras Oncogenes Upregulate VEGF/VPF Expression:Implications for Induction and Inhibition of Tumor Angiogenesis［J］.Cancer Res，1995，55（20）:4575-4580.

［10］Huppert JL，Balasubramanian S.G-quadruplexes in promoters throughout the human genome［J］.Nucleic Acids Res，2007，35（2）:406-413.

［11］Bochman ML，Paeschke K，et al.DNA secondary structures: stability and function of G quadruplex structures［J］.Reviews，2012，13（11）:770-780.

· 臨床研究 ·

中圖分類號(hào)：R735.3+5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1671-8194（2016）13-0039-03

基金項(xiàng)目：山西省青年科技基金（2011021035-1）