左 躍, 張克勤

(1. 同濟大學醫(yī)學院，上海 200092； 2. 同濟大學附屬同濟醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200065)

?

·基礎研究·

siRNAs對ACVR1基因的沉默效果

左 躍1, 張克勤2

(1. 同濟大學醫(yī)學院，上海 200092； 2. 同濟大學附屬同濟醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200065)

目的 比較五種不同的siRNA對進行性骨化性纖維增殖不良癥模型細胞中ACVR1基因的抑制效果。方法 實驗組分為A、B、C、D、E五組，分別轉(zhuǎn)染五種不同序列的siRNA，對照組轉(zhuǎn)染通用陰性siRNA和試劑。轉(zhuǎn)染36h后，采用實時熒光定量PCR檢驗各實驗組對ACVR1基因的抑制率。結果 與試劑對照組相比，只有E組觀察到了25.5%的抑制率(P>0.05)，其余各組未觀察到抑制效果。結論 可以排除四種siRNA序列對ACVR1基因不具有抑制作用。轉(zhuǎn)染正義鏈序列為5′-CCAGGUGGAUUGUUUCGAU-3′的siRNA對ACVR1基因可能有抑制作用。

進行性骨化性纖維增殖不良癥； 小干擾RNA； ACVR1基因

進行性骨化性纖維增殖不良癥(fibrodysplasia ossificans progressiva, FOP)是一種罕見的嚴重致殘性骨病，其病因是由于ACVR1基因發(fā)生雜合性激活性點突變c.617G>A (R206H)，導致骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)信號通路增強[1]。BMP信號通路是體內(nèi)很多器官和組織發(fā)揮功能所必須的。目前，大部分治療FOP的藥物會阻斷全部BMP信號通路，因此帶來很大的副作用[2]。僅僅阻斷突變型ACVR1(Mutant, M)而不影響正常的ACVR1受體下游信號轉(zhuǎn)導成為治療FOP的理想方法。為了對比只針對突變基因特異性的小干擾RNA(allele-specific small interfering RNA, ASP-siRNA)[3]和針對全部ACVR1基因(包括突變型和野生型)的小干擾RNA(non-allele-specific small interfering RNA, NASP-siRNA)對FOP模型細胞的ACVR1基因的抑制效果，本實驗在Medici等[4]建立的FOP模型細胞基礎上，轉(zhuǎn)染兩種ASP-siRNA和三種NASP-siRNA，通過RT-qRCR比較這些siRNA對ACVR1基因的干擾沉默效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和器材

人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)購自美國模式培養(yǎng)物集存庫；攜帶有ACVR1R206H基因綠色熒光蛋白標記(GFP)的腺病毒[Ad-ACVR1(M)-IRES-GFP]購自英濰捷基公司；內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基購自Lonza公司；胎牛血清、青鏈霉素、內(nèi)皮細胞無血清培養(yǎng)基、成骨誘導培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000等購自Gibco公司；RNAiso Plus、無RNA酶的水、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒(SYB Green法)購自TaKaRa公司；2×Taq PCR Master Mix購自上海萊楓生物科技有限公司；細胞培養(yǎng)皿和6孔板購自美國Corning公司；RT-qPCR儀為Roche Lightcycler 1.5。siRNA和通用的siRNA陰性對照由上海拓然生物科技有限公司化學合成，均在正義鏈的5′端加上膽固醇基團修飾。其中，兩種ASP-siRNA序列引自Kaplan等[3]。ACVR1引物、GAPDH引物由生物工程(上海)有限公司設計合成。

1.2 分組

實驗組分為轉(zhuǎn)入ASP-siRNA的A、B組，轉(zhuǎn)入NASP-siRNA的C、D、E組，對照組為轉(zhuǎn)入通用siRNA的陰性對照組(NC組)及未轉(zhuǎn)入siRNA的試劑對照組(Mock組)，試劑對照組除了不含siRNA，其余步驟相同。各個實驗組轉(zhuǎn)入的siRNA序列見表1。

表1 各實驗組轉(zhuǎn)入siRNA的序列

1.3 方法

1.3.1 細胞模型構建和siRNA轉(zhuǎn)染 細胞培養(yǎng)方法參考文獻[4]： 將HUVEC復蘇于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中，置于 37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。待培養(yǎng)皿中細胞融合80%以上后，接種于6孔板中。轉(zhuǎn)染攜帶有ACVR1R206H基因綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)標記的腺病毒[Ad-ACVR1(M)-IRES-GFP]后在內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦杉毎麡訒r開始成骨誘導[4]。細胞成骨誘導3d后，細胞密度在50%左右，開始轉(zhuǎn)染siRNA： 先給6孔板換液，每孔含未添加血清和抗生素的成骨誘導培養(yǎng)基 1.5ml；用250μl 不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋5μl siRNA儲存液(20μmol/L)，輕輕混勻，室溫孵育5min；用250μl不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋3μl LipofectamineTM2000，輕輕混勻，室溫孵育5min；將上述稀釋后的siRNA和稀釋后的Lipofectamine2000輕輕混勻，室溫孵育 20min 后，加入含有細胞的1.5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，輕輕混勻，siRNA終濃度為50nmol/L。

1.3.2 提取總RNA和RT-qPCR 轉(zhuǎn)染結束36h后，使用RNAiso PLus、氯仿(三氯甲烷)、異丙醇、乙醇、無RNA酶的水等試劑提取各組細胞總RNA；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件為37℃ 15min，85℃ 5s。ACVR1引物： 擴增包括突變型和野生型的全部ACVR1基因，正義： 5′-GAA-GGTCTCTCCTGCGGTAA-3′，反義： 5′-AGG-TCATCTTTCCCTGCTCA-3′，擴增產(chǎn)物為 130bp 片段。根據(jù)RT-qPCR試劑盒(SYB Green法)使用說明，使用上述ACVR1引物對目的基因進行擴增，以GAPDH為內(nèi)參。1階段： 95℃ 30s；2階段： 95℃ 5s，60℃ 20s，40 個循環(huán)；3階段： 95℃ 0s，65℃ 15s，95℃ 0s。實驗重復3次。采用2-△△CT方法分析結果[5]： 每一樣品的目的基因CT值減去該樣品相應的內(nèi)參GAPDH的CT值即為△CT，以2-△CT表示該樣品的目的基因mRNA相對表達量。轉(zhuǎn)染了siRNA組的基因抑制率=(1-2-△△CT)×100%，其中-△△CT=-(該組的△CT-Mock組△CT)。

每組的cDNA分別經(jīng)普通PCR擴增，體系配制和反應條件按照2×Taq PCR Master Mix說明書，擴增產(chǎn)物用含0.1μg/ml GoldView的2%瓊脂糖凝膠在1×TAE電泳緩沖液中電泳200V 25min，電泳后紫外燈下觀察是否有擴增成功的ACVR1目的基因條帶和GAPDH條帶，以及有無雜帶并拍照記錄。

1.4 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計分析軟件為SPSS 21.0，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組cDNA普通PCR擴增產(chǎn)物電泳

圖1中可見ACVR1目的基因條帶和內(nèi)參GAPDH條帶，無其他非特異性條帶，表明總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄為cDNA成功，引物設計符合要求，無非特異性產(chǎn)物。

圖1 各組cDNA經(jīng)普通PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR products of cDNA in each groupA： 目的基因ACVR1；B： 內(nèi)參基因GAPDH

2.2 RT-qPCR結果

所有的擴增曲線正常，溶解曲線呈單峰，表明沒有非特異性產(chǎn)物。與試劑對照Mock組比較，A組目的基因表達量增加了2.336倍(P<0.05)，B組目的基因表達量增加了1.588倍(P<0.05)，C組目的基因表達量增加了0.202倍(P>0.05)，D組目的基因表達量增加了0.894倍(P>0.05)，E組目的基因表達量下降了25.5%，即抑制率為25.5%(P>0.05)，NC組目的基因表達量增加了2.904倍(P<0.05)。實驗組中的A、B、C、D組和NC組對FOP模型細胞的ACVR1基因沒有抑制作用，實驗組中的E組對FOP模型細胞的ACVR1基因的抑制率為25.5%，差異無統(tǒng)計學意義。

3 討 論

FOP又叫骨化性肌炎，俗稱“木頭人”，是一種罕見的嚴重致殘性骨病，其特點為先天性大腳趾畸形和進行性異位成骨[1]。臨床表現(xiàn)為創(chuàng)傷、肌肉拉伸、肌肉注射等誘發(fā)或自發(fā)的軟組織腫脹疼痛，逐漸在軟組織內(nèi)異位成骨，如果發(fā)生在關節(jié)處則可以引起關節(jié)僵硬和活動受限[1]，有的患者甚至雙膝關節(jié)受累，導致雙腿固定而無法行走。典型的FOP病因是由于ACVR1基因發(fā)生雜合性激活性點突變(c.617G>A)，該基因編碼的膜受體ACVR1/ALK2蛋白屬于BMP Ⅰ型受體基因突變發(fā)生在ACVR1/ALK2蛋白GS區(qū)域，下游BMP信號通路增強[6]。目前，該病沒有明確的治療手段，重在預防和避免摔倒、外傷、感染，肌肉注射等可能加重病情或?qū)е庐愇怀晒堑囊蛩豙1]。所以，研發(fā)新的有效藥物迫在眉睫。

ACVR1受體的下游BMP信號通路不僅僅是ACVR1也是很多其他膜受體的共同下游信號通路，是大部分組織細胞的正常功能所必須的，如果阻斷全部BMP信號通路，則有可能會帶來很大的副作用[2]。所以，單純阻斷突變的ACVR1(M)受體或者其相應的突變型mRNA(M)理論上應該副作用最小。因此，只針對突變型mRNA(M)設計、與包含突變位點在內(nèi)的一段cDNA序列同源的siRNA理論上應該具有等位基因特異性，有可能成為一種理想的治療手段。目前國內(nèi)外對于FOP的治療學研究中很少有關于siRNA方面的報道，其中Kaplan等[3]和Takahashi等[7]已經(jīng)成功使用等位基因特異性的ASP-RNAi，使突變型的ACVR1 mRNA降解，選擇性地抑制ACVR1(M)功能。

siRNA是一種長度為21～28個核糖核苷酸構成的RNA雙鏈，其與細胞中的誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex, RISC)結合后，可以靶向切割與siRNA正義鏈序列完全相同的同源性mRNA從而導致其降解，在mRNA水平上使靶基因沉默[8]。但是不是所有針對靶基因設計的siRNA都具有干擾效果，實驗驗證是必要的。因此在本實驗中，通過RT-qPCR實驗驗證了兩種ASP-siRNA和三種NASP-siRNA對ACVR1基因是否具有抑制效果，此外，siRNA化學合成法簡便易行，且在siRNA正義鏈的5′端加上膽固醇基團修飾，可以增加siRNA的穩(wěn)定性，促進其進入細胞[9]，可以減少轉(zhuǎn)染試劑的使用量和細胞毒性。

在本實驗中，轉(zhuǎn)染了ASP-siRNA的A組和B組都沒有表現(xiàn)出抑制效果，提示需要考慮重新設計針對ACVR1(M)等位基因特異性的siRNA；轉(zhuǎn)染了NASP-siRNA的實驗組中，C組和D組都沒有表現(xiàn)出抑制效果；上述各實驗組中轉(zhuǎn)染的siRNA序列都可以排除對ACVR1基因的抑制作用。E組所轉(zhuǎn)染的正義鏈序列為5′-CCAGGUGGAUUGUUUCG-AU-3′的NASP-siRNA對ACVR1目的基因的沉默抑制率為25.5%，雖然差異經(jīng)檢驗沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，有可能是因為樣本量太小(n=3)，統(tǒng)計學檢驗效能太低，沒有得出有差異的結論，不過可以為以后的實驗提供可靠的參考。在后面的實驗研究中，可以從擴大樣本量，提高轉(zhuǎn)染siRNA的終濃度，延長從轉(zhuǎn)染到提取總RNA的時間，以及應用更加準確的RT-qPCR數(shù)據(jù)分析方法等方面改進，有可能需要重新設計效果更好的ASP-siRNA。此外，本研究只探討了siRNA對總的ACVR1基因的抑制效果比較，siRNA對FOP細胞模型ACVR1基因的野生型和突變型的抑制分別為多少以及下游信號通路的變化還有待于進一步實驗觀察。而且，將siRNA應用于人體內(nèi)治療還需要考慮增加siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性而不降低其干擾活性，提高靶向性及應用合適的體內(nèi)遞送載體等[10]。

[1] Pignolo RJ, Shore EM, Kaplan FS. Fibrodysplasia ossificans progressiva： clinical and genetic aspects[J]. Orphanet J Rare Dis，2011，6： 80.

[2] Lowery JW, Rosen V. Allele-specific RNA interfer-ence in FOP silencing the FOP gene[J]. Gene Ther，2012，19(7)： 701-702.

[3] Kaplan J, Kaplan FS, Shore EM. Restoration of normal BMP signaling levels and osteogenic differentiation in FOP mesenchymal progenitor cells by mutant allele-specific targeting[J]. Gene Ther，2012，19(7)： 786-790.

[4] Medici D, Shore EM, Lounev VY, et al. Conversion of vascular endothelial cells into multipotent stem-like cells[J]. Nat Med，2010，16(12)： 1400-1406.

[5] 潘沛江，葉力，陳暉，等.siRNA對人-單核巨噬細胞TLR2基因表達的抑制[J].中國免疫學雜志，2014，3(8)： 1032-1035.

[6] Pignolo RJ, Shore EM, Kaplan FS. Fibrodysplasia ossificans progressiva： diagnosis, management, and therapeutic horizons[J]. Pediatr Endocrinol Rev，2013, 10(Suppl 2)： 437-448.

[7] Takahashi M, Katagiri T, Furuya H, et al. Disease-causing allele-specific silencing against the ALK2 mutants, R206H and G356D, in fibrodysplasia ossifi-cans progressiva[J]. Gene Ther，2012，19(7)： 781-785.

[8] 胡迎賓，李定國.siRNAs在基因治療中的應用[J].世界華人消化雜志，2005，13(16)： 2040-2042.

[9] 孫麗萍，翁建，張秀明，等.siRNA的化學修飾和臨床應用[J].生命的化學，2005，25(4)： 339-342.

[10] 葛華，王清清，宋海峰，等.siRNA體內(nèi)遞送研究進展[J].中國新藥雜志，2010,19(12)： 1031-1035.

Effects of siRNAs on ACVR1 gene

ZUOYue1,ZHANGKe-qin2

(1． Medical College，Tongji University, Shanghai 200092, China；2. Dept. of Endocrinology, Tongji Hospital，Tongji University, Shanghai 200065, China)

Objective To compare the effects of five different siRNAs on ACVR1 gene in fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) cells. Methods Five different siRNAs were trensfected into cultured FOP cells (groups A, B, C, D, E), non-trensfected FOP cells (negative control) and mock-transfected cells (mock transfection control) were used as controls. Real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) was performed at 36h after transfection. Results Only a 25.5% suppression of ACVR1 was observed in group E (P>0.05). Conclusion siRNA with sense strand 5′-CCAGGUGGAUUGUUUCGAU-3′ may suppress the ACVR1 gene, while other 4 studied seque-nces are not effective.

fibrodysplasia ossificans progressiva； small interfering RNA； ACVR1 gene

10.16118/j.1008-0392.2016.01.007

2015-09-04

國家自然科學基金(81170802)

左 躍(1989—)，女，碩士研究生.E-mail： zuoyue1989@163.com

張克勤.E-mail： keqzhang2007@126.com

R 392.2

A

1008-0392(2016)01-0033-04