薛莉花 武興斌 連佛彥 潘劍

摘要：目的 觀察銀杏葉提取物EGb761對(duì)人腦神經(jīng)瘤母細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響，探討其作用機(jī)制。方法 采用細(xì)胞培養(yǎng)方法，建立SH-SY5Y細(xì)胞1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）損傷帕金森病體外模型。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組和中藥低、中、高劑量組，各給藥組給予相應(yīng)劑量藥物。MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，AnnexinV凋亡檢測(cè)試劑盒和流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率；倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；硝酸還原法檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞一氧化氮（NO）的含量。結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組SH-SY5Y細(xì)胞存活率降低、細(xì)胞凋亡率增加和NO含量升高（P<0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組SH-SY5Y細(xì)胞存活率增加、細(xì)胞凋亡率降低，NO含量降低（P<0.05）。結(jié)論 銀杏葉提取物EGb761可以通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)NO自由基的含量對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：銀杏葉提取物EGb761；SH-SY5Y細(xì)胞；帕金森?。灰谎趸杂苫?/p>

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.018

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）07-0070-04

Effects of Extract of Ginkgo biloba Leaves EGb761 on MPP+-induced Injury in SH-SY5Y Cells XUE Li-hua， WU Xing-bin， LIAN Fo-yan， PAN Jian （Second Hospital Affiliated to Lanzhou University， Lanzhou 730030， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of extract of Ginkgo biloba leaves EGb761 on 1-methy-l 4-phenylpyridium （MPP+）-induced injury in human neuroblastoma SH-SY5Y cells； To discuss its mechanism of action. Methods Cell culture method was used and SH-SY5Y cell damage model was induced with different concentrations of MPP+ to build Parkinsons disease model in vitro. The experiment was divided into control group， MPP+ model group， low-， medium-， and high-dose EGb761 groups. The survival rate was determined by MTT assay， and the apoptotic rate was detected by flow cytometry according to AnnexinV apoptosis detection kit. The cell morphology was observed by inverted microscope. NO content in SH-SY5Y cells was detected by Nitric acid reduction method. Results Compared with the control group， the survival rate of SH-SY5Y cells decreased and the apoptotic rate and NO content increased in the model group （P<0.05）； Compared with the model group， the survival rate of SH-SY5Y cells increased and the apoptotic rate and NO content decreased in the low-， medium- and high-dose EGb761 groups （P<0.05）. Conclusion EGb761 can protect MPP+-induced SH-SY5Y cell from damage by the inhibition of the content of NO free radical.

Key words： extract of Ginkgo biloba leaves EGb761； SH-SY5Y cell； Parkinsons disease； NO free radical

帕金森?。≒arkinsons disease，PD）是一種表現(xiàn)為功能性障礙的神經(jīng)退行性疾病。臨床上主要有靜止性震顫?肌肉僵直和運(yùn)動(dòng)遲緩等表現(xiàn)癥狀。PD是由多巴胺能神經(jīng)元死亡引起的，其機(jī)制在于黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性中存在的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[1]。隨著人口老齡

基金項(xiàng)目：甘肅省科技計(jì)劃項(xiàng)目（145RJZA143）

通訊作者：潘劍，E-mail：ldeypj@163.com

化的速度加快，PD等神經(jīng)退行性疾病在老年人中的發(fā)病率逐漸升高。據(jù)研究顯示，全球每年大約有400萬(wàn)新增患者[2]。PD治療仍缺乏有效的藥物，目前臨床治療PD的藥物主要為膽堿脂酶抑制劑和NMDA受體拮抗劑，該類藥物雖能改善PD患者的認(rèn)知和記憶功能，但無(wú)法有效地控制PD患者的病理進(jìn)展。因此，尋找一種能夠延緩或逆轉(zhuǎn)PD的病理進(jìn)展的藥物，仍然是當(dāng)前PD研究的難點(diǎn)。近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)PD機(jī)制研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)中藥具有延緩PD進(jìn)展的作用[3-4]。由于中醫(yī)藥在防治PD等老年性疾病方面有豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)且毒性相對(duì)較小，逐漸受到研究者們的關(guān)注。研究顯示，銀杏葉提取物具有抑制細(xì)胞凋亡和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞損傷等生理作用[5]。本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞培養(yǎng)方法，建立SH-SY5Y細(xì)胞1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）損傷PD體外模型，觀察銀杏葉提取物EGb761對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

SH-SY5Y細(xì)胞株，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物

EGb761（含24%黃酮糖苷和6%銀杏苦內(nèi)酯-白果內(nèi)酯的銀杏葉提取物），40 mg/粒，法國(guó)博福-益普生制藥工業(yè)公司，批號(hào)H03736。

1.3 主要試劑與儀器

胰蛋白酶，南京森貝伽生物科技有限公司； MPP+、MTT、DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS），Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）?雙抗（青?鏈霉素），南京維森特生物技術(shù)有限公司；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，北京寶賽生物技術(shù)有限公司；一氧化氮（NO）試劑盒，上海谷研實(shí)業(yè)有限公司。Diaphot倒置顯微鏡、高速離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司），流式細(xì)胞儀（FACSCalibuar，BD），CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Shellab公司），超凈工作臺(tái)（新加坡ESCO公司）。

1.4 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)

將SH-SY5Y細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞密度為1.2×104個(gè)/cm2。采用DMEM培養(yǎng)基（10%FBS，青霉素100 U/mL和鏈霉素100 U/mL），置于37 ℃?5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。

1.5 分組、造模及給藥

采用MPP+誘導(dǎo)細(xì)胞建立SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷模型。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組和中藥低、中、高劑量組。對(duì)照組為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基（不含10%FBS），模型組為含有1 mmol /L MPP+的無(wú)血清培養(yǎng)基，中藥低、中、高劑量組分別含有2.5、5、10 g/L EGb761及10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

用0.25%胰酶將細(xì)胞稀釋為5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸浮液，接種于96孔板中，每孔加200 μL懸液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加20 μL濃度為0.5 g/L的MTT，繼續(xù)孵育4 h。棄去培養(yǎng)基，加200 μL DMSO，震蕩1 min，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)各孔吸光度（OD）值，取其平均值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值÷對(duì)照組OD值×100%。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

用PBS清洗細(xì)胞2次，用不含EDTA 0.25%胰酶消化SH-SY5Y細(xì)胞，收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞2次，2000 r/min離心3 min，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104個(gè)/mL。各組細(xì)胞孵育24 h后，加入500 μL Binding Buffer?5 μL AnnexinV-FITC及5 μL碘化丙啶混勻，室溫避光反應(yīng)10 min，于室溫下避光反應(yīng)10 min，進(jìn)行觀察和檢測(cè)分析。細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)÷（凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.8 硝酸還原法測(cè)定一氧化氮含量

分別取形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)中5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，反復(fù)凍融3次使細(xì)胞破裂，收集培養(yǎng)液100 μL，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，分別測(cè)得各組OD值，計(jì)算NO含量?

1.9 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰酶調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸浮液，接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)?細(xì)胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析及LSD-t檢驗(yàn)?P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?

2 結(jié)果

2.1 EGb761對(duì)MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響

與對(duì)照組比較，模型組SH-SY5Y細(xì)胞存活率下降（P<0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組SH-SY5Y細(xì)胞存活率升高（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 EGb761對(duì)MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較，模型組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 EGb761對(duì)MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞一氧化氮含量的影響

與對(duì)照組比較，模型組SH-SY5Y細(xì)胞NO含量升高（P<0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組SH-SY5Y細(xì)胞NO含量降低（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 EGb761對(duì)MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響

對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞多呈梭形或橢圓形，細(xì)胞表面有少量細(xì)長(zhǎng)突起，細(xì)胞狀態(tài)增殖良好；模型組SH-SY5Y細(xì)胞皺縮成圓形或橢圓形，邊界模糊，細(xì)胞形態(tài)差異較大，有較明顯的凋亡特征；中藥各劑量組細(xì)胞亦有少數(shù)細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象發(fā)生，但是明顯少于模型組，細(xì)胞皺縮現(xiàn)象減少，細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯增多，細(xì)胞生長(zhǎng)較均勻，外形規(guī)則，正常突起較多。結(jié)果見(jiàn)圖1。

3 討論

人神經(jīng)瘤母細(xì)胞SH-SY5Y衍生于人的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-N-SH，是一種重要的具有多巴胺能特性的神經(jīng)瘤細(xì)胞，是研究神經(jīng)元凋亡的最常用細(xì)胞模型。MPP+可選擇性誘導(dǎo)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元缺失，通過(guò)使線粒體能量缺失，降低細(xì)胞膜電位、損傷線粒體呼吸鏈，從而導(dǎo)致過(guò)氧化產(chǎn)物和自由基增加，引起細(xì)胞的凋亡[6-7]，是公認(rèn)的能誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的細(xì)胞毒素。實(shí)驗(yàn)常用MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞來(lái)模擬PD體外模型[8-9]?因此，本實(shí)驗(yàn)采用MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡作為PD體外模型?

銀杏葉提取物EGb761含有多種活性成分，如黃酮類?萜內(nèi)酯類?酚酸類化合物等。黃酮類與糖苷結(jié)合具有清除氧自由基，對(duì)抗興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、拮抗血小板活化因子等藥理活性[10-11]，并能降低MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1 mmol/L MPP+使SH-SY5Y細(xì)胞存活率下降至43.66%，5、10 g/L EGb761均能提高SH-SY5Y細(xì)胞存活率。2.5、5、10 g/L EGb761分別與MPP+同時(shí)處理細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率由模型組的89.32%分別降至73.61%、33.68%、15.76%。

細(xì)胞凋亡是在病理和生理?xiàng)l件下細(xì)胞的一種主動(dòng)死亡過(guò)程，主要包括細(xì)胞皺縮變圓，與相鄰細(xì)胞分離，細(xì)胞漿和染色質(zhì)濃縮，導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)陷，細(xì)胞分離成多個(gè)凋亡小體。近年來(lái)，隨著人們對(duì)于細(xì)胞凋亡機(jī)制的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)有很多物質(zhì)諸如小分子化合物NO參與了凋亡的過(guò)程。NO是一種自由基，也是體內(nèi)重要的信使分子，可以通過(guò)多種途徑影響細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞在病理狀態(tài)下，一氧化氮合酶得到活化，產(chǎn)生大量的NO，NO通過(guò)誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤細(xì)胞及周圍細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。NO發(fā)揮促進(jìn)凋亡的機(jī)制可能為：①NO通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原電位，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，活化細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。②通過(guò)抗氧自由基活性，減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的生成，從而保護(hù)細(xì)胞膜的完整性。③保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)功能的完整性，防止細(xì)胞凋亡的發(fā)生?本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞經(jīng)1 mmol /L MPP+處理后NO含量升高，當(dāng)加入不同劑量EGb761后，SH-SY5Y細(xì)胞NO含量降低。本研究使用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，模型組細(xì)胞顯示出明顯的凋亡特征，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)不同濃度EGb761處理后，中藥各劑量組細(xì)胞亦有細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象發(fā)生，但是明顯少于模型組。

綜上所述，EGb761能夠顯著降低MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，從而起到保護(hù)細(xì)胞損傷的作用，推測(cè)其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞內(nèi)NO自由基的含量有關(guān)。

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（收稿日期：2015-07-26）

（修回日期：2015-08-22；編輯：華強(qiáng)）