許京鋒，尚青華，王　欣，徐　浩

冠心病“毒證”與傳統(tǒng)外科“毒證”蛋白質(zhì)組學(xué)差異研究

許京鋒，尚青華，王欣，徐浩

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院(北京 100091)

摘要：目的 通過(guò)對(duì)中醫(yī)傳統(tǒng)“毒證”和冠心病(CHD)“毒證”的組間比較，探討冠心病“毒證”的特異蛋白表達(dá)，為冠心病“毒證”理論的生物學(xué)基礎(chǔ)提供依據(jù)。方法選擇急性心肌梗死(AMI)、傳統(tǒng)外科“毒證”病人各15例，采用Matrix Assisted Laser Desorption Ionization/Time-of-Flight Mass Spectroscopy(Maldi-Tof-MS)方法對(duì)兩組人群血清蛋白進(jìn)行比較分析和鑒定，最終確定CHD“毒證”和傳統(tǒng)毒證的差異蛋白。結(jié)果共找到4個(gè)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白多肽鏈，其中分子量為 2 022.61Da 的多肽鏈LOC653879(補(bǔ)體3類(lèi)似物，Similar to Complement C3)組間差異最大，且能很好地將這兩組區(qū)分；用QC方法建立的模型示該蛋白多肽鏈能夠很好地與其他蛋白相結(jié)合，得到的識(shí)別率為 93.33%。結(jié)論補(bǔ)體C3類(lèi)似物L(fēng)OC653879是區(qū)別冠心病“毒證”與傳統(tǒng)外科“毒證”的關(guān)鍵蛋白，值得進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：冠心病；毒證； 蛋白組學(xué)

“毒證”一般多見(jiàn)于溫?zé)岵『屯饪瓢b疽疔瘡，以紅、腫、熱、痛等為臨床特點(diǎn)，在病理上常認(rèn)為初起為溫，溫甚為熱，熱甚為火，火入血分則為毒，或初為濕盛，久郁化熱，濕熱釀毒?！抖咀C論》中將“毒證”的臨床特征概括為：爆發(fā)性、劇烈性、危重性、傳染性、難治性、頑固性，將“毒證”的病變特征歸納為：傳遞迅速、易于惡化、兼火兼熱、夾瘀夾痰、入經(jīng)入絡(luò)、傷陰傷陽(yáng)。張哲等[1]提出冠心病(CHD)的“脈瘤”“脈癰”理論，與外科“毒證”有相似之處；臨床中也發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死(AMI)具有起病急驟、傳變迅速、病勢(shì)兇險(xiǎn)等特點(diǎn)，類(lèi)似于CHD“毒證”；且越來(lái)越多的研究表明[2-6]，無(wú)論從臨床癥狀還是從實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)上，解毒中藥對(duì)急性冠脈綜合征(ACS)均有明確療效。但CHD“毒證”與傳統(tǒng)“毒”中瘡瘍紅腫熱痛、舌質(zhì)紅絳等表象并不完全相符[7]，因此，CHD“毒證”與傳統(tǒng)意義的“毒證”有何不同？是否有特異性的分子標(biāo)記物？本研究即通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較中醫(yī)傳統(tǒng)外科“毒證”和CHD“毒證”的差異蛋白，探討冠心病“毒證”的特異蛋白表達(dá)，以期為冠心病“毒證”理論的生物學(xué)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1資料與方法

1．1診斷標(biāo)準(zhǔn)AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)，參照2001年中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管分會(huì)“AMI診斷和治療指南”中AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。外科“毒”的診斷標(biāo)準(zhǔn)，癰腫瘡癤或急性扁桃體炎等具有典型紅、腫、熱、痛表現(xiàn)[9-10]。

1．2納入標(biāo)準(zhǔn)AMI；年齡35歲～80歲。符合AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)者，即具備下列三條標(biāo)準(zhǔn)中的兩條：缺血性胸痛的臨床病史；心電圖的動(dòng)態(tài)演變；心肌壞死的血清心肌標(biāo)記物濃度的動(dòng)態(tài)改變。中醫(yī)傳統(tǒng)“毒”證[11]：年齡18歲～80歲；皮膚、肌肉或臟器的癰疽疔瘡以高熱、紅腫熱痛或明確細(xì)菌感染性疾病的病人，如腸癰(急性闌尾炎)、乳癰(急性乳腺炎)、肺癰(急性肺炎)、肝癰(急性肝膿腫)、丹毒(急性蜂窩組織炎)等；體溫≥37．5℃或白細(xì)胞總數(shù)>10×109/L且中性粒細(xì)胞百分比>70%。

1．3排除標(biāo)準(zhǔn)AMI；近1個(gè)月內(nèi)有感染、發(fā)熱、創(chuàng)傷、燒傷、手術(shù)史；嚴(yán)重心力衰竭，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)<35%者；惡性腫瘤；活動(dòng)性風(fēng)濕免疫性疾病、結(jié)核??；肝硬化、腎衰竭(Cr>2．0 mg/dL)或臟器移植者；嚴(yán)重慢阻肺，呼吸衰竭或肺心病、右心衰；嚴(yán)重血液系統(tǒng)疾病如白血病、再障；估計(jì)依從性較差或參加其他臨床試驗(yàn)者。中醫(yī)傳統(tǒng)“毒”證，往有明確CHD病史者；癰疽疔瘡已破潰，流膿已盡，屬于愈合期者；腸癰、乳癰等已行手術(shù)治療者。

1．4觀察指標(biāo)及血清多肽譜實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)病例報(bào)告表詳細(xì)記錄各組一般資料、既往史、個(gè)人史、癥狀、體征、辨證分型等。信息采集、錄入人員均為心血管科專(zhuān)科醫(yī)師并接受過(guò)統(tǒng)一培訓(xùn)考核，所有錄入信息由課題組主要研究人員進(jìn)行核查確認(rèn)后，方為有效。數(shù)據(jù)錄入采用雙人錄入，確保資料的準(zhǔn)確可靠。中醫(yī)的辨證分型由兩名副高以上中西醫(yī)結(jié)合心血管醫(yī)師確認(rèn)。同時(shí)留取空腹血清-80℃凍存，用于最后統(tǒng)一的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)。采用 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization/Time-of-Flight Mass Spectroscopy (Maldi-Tof-MS)方法對(duì)冠心病“毒證”和傳統(tǒng)外科“毒證”兩組人群的差異蛋白進(jìn)行比較分析和鑒定，最終確定冠心病“毒證”的特異表達(dá)蛋白。采用 ClinProTool2．1 軟件進(jìn)行圖譜分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用BioworksBrowser 3．3．1 SP1 進(jìn)行 SequestTM檢索， 檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為 International Protein Index (IPI human v3．45 fasta with 71983 entries)。

2結(jié)果

2．1一般資料分析共入選中日友好醫(yī)院急診科冠心病“毒證”即AMI病人、中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院外科中醫(yī)傳統(tǒng)“毒證”病人各15例。冠心病“毒證”15例，年齡(63．40±8．53)歲，男性9例(60．00%)，女性6例(40．00%)；15例傳統(tǒng)外科“毒證”病人中，年齡(50．87±14．92)歲，男性11例(73．33%)，女性4例(26．67%)。年齡、 高血壓病史、 腦卒中病史及心率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0．05)，但考慮到疾病本身的特點(diǎn)，認(rèn)為這符合真實(shí)世界的狀態(tài)。詳見(jiàn)表1。

表1　AMI組和傳統(tǒng)外科“毒證”的基線資料

2．2AMI與傳統(tǒng)外科“毒證”差異蛋白的多肽譜分析共找到4個(gè)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白多肽鏈。詳見(jiàn)表2。選擇組間差異最大的蛋白多肽鏈進(jìn)行鑒定，即分子量為2 022．61Da的多肽鏈。圖1中可見(jiàn)分子量為2 022．61Da的蛋白多肽鏈兩組間的峰值及峰面積差異顯著；圖2中可見(jiàn)CHD“毒證”組與傳統(tǒng)外科“毒證”組比較所得到的差異蛋白多肽鏈能夠很好地將這兩組區(qū)分；用QC方法建立的模型，分子量為2 022．61的蛋白多肽鏈能夠很好地與其他蛋白相結(jié)合，得到的識(shí)別率為93．33%。詳見(jiàn)表2、圖1、圖2。

表2　CHD“毒證”與傳統(tǒng)外科“毒證”差異蛋白多肽譜分析

注：實(shí)線為冠心病“毒證”；虛線為傳統(tǒng)外科“毒證”。

圖1分子量為2 022．61Da的蛋白峰分布

注：實(shí)線為CHD“毒證”；虛線為傳統(tǒng)外科“毒證”。

圖2分子量為2 022．61Da的蛋白多肽鏈判別兩組樣本的分布情況

2．3CHD“毒證”與傳統(tǒng)外科“毒證”差異蛋白鑒定(見(jiàn)表3)

表3　CHD“毒證”與傳統(tǒng)外科“毒證”相關(guān)蛋白鑒定

3討論

本研究中CHD“毒證”組——AMI組補(bǔ)體C3 類(lèi)似物L(fēng)OC653879表達(dá)較高。補(bǔ)體C3作為天然的免疫分子，是人體最主要的補(bǔ)體成分之一，主要由肝臟和巨噬細(xì)胞合成，在補(bǔ)體C3轉(zhuǎn)化酶的作用下，裂解成C3a和C3b兩個(gè)片段，在人體補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑和旁路激活途徑中發(fā)揮著重要作用，也參與人體第三條補(bǔ)體激活途徑——甘露聚糖結(jié)合凝集素途徑的啟動(dòng)。通過(guò)EMBL-EBI中Uniprot查找該蛋白的主要功能包括：無(wú)論在經(jīng)典激活途徑還是在替代激活途徑，都需要補(bǔ)體C3轉(zhuǎn)化酶的參與，在這個(gè)過(guò)程中C3b通過(guò)活性硫酯的作用與細(xì)胞表面的碳水化合物結(jié)合形成免疫聚集物；C3a過(guò)敏毒素能夠介導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)，引起平滑肌收縮，增加血管的通透性，促進(jìn)組胺的釋放；?；饔么碳さ鞍滓彩茄a(bǔ)體C3裂解后的一條多肽鏈，與脂肪代謝有關(guān)，它能夠刺激TG合成和脂肪細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)脂肪的儲(chǔ)存，對(duì)調(diào)節(jié)餐后TG水平起著重要作用，其促進(jìn)TG合成的作用是通過(guò)激活PLC、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase，MAPK)和 蛋白激酶AKT的信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。補(bǔ)體C3增高常見(jiàn)于某些急性炎癥或者傳染病早期，如急性腎小球腎炎、風(fēng)濕熱急性期、心肌炎、心肌梗死、關(guān)節(jié)炎等；降低常見(jiàn)于：① 補(bǔ)體合成能力下降，如慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬化、肝壞死等；② 補(bǔ)體消耗或者丟失過(guò)多，如活動(dòng)性紅斑狼瘡、急性腎小球腎炎晚期、基底膜增生型腎小球腎炎、嚴(yán)重類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、冷球蛋白血癥、大面積燒傷等；③ 補(bǔ)體合成原料不足，如兒童營(yíng)養(yǎng)不良性疾?。虎?先天性補(bǔ)體缺乏，常可致嚴(yán)重感染等。

目前有研究表明補(bǔ)體C3與心肌損傷、血栓形成及CHD有關(guān)[12-14]；一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[15]，以C3為主的局部補(bǔ)體激活可以促進(jìn)AMI病人血管的閉塞過(guò)程；近來(lái)又有報(bào)道認(rèn)為，女性TG-C3組合升高提示抗炎能力和動(dòng)脈保護(hù)功能的受損，可能預(yù)測(cè)糖尿病或者CHD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[16]。另外一項(xiàng)關(guān)于ACS病人HDL水平與炎癥反應(yīng)關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)[17]：ACS病人除了HDL的降低，還伴有明顯的補(bǔ)體C3的升高。總之炎癥反應(yīng)貫穿于AS、CHD始終，與ACEs的發(fā)生密切相關(guān)，而CHD和ACEs病人補(bǔ)體C3水平增高可能與體內(nèi)炎癥-免疫機(jī)制激活有關(guān)。

在外科感染性疾病當(dāng)中，馬曉望等[18]的研究表明，外科局灶性感染組在感染早期、晚期C3值均無(wú)明顯變化，但重癥感染組的C3值卻低于正常值，這說(shuō)明當(dāng)少量毒力的細(xì)菌侵入人體，機(jī)體只需啟動(dòng)體液內(nèi)的免疫球蛋白及少量補(bǔ)體就可以防止感染擴(kuò)散，但在重癥感染時(shí)，由于大量抗原抗體復(fù)合物形成以及LPS的作用，消耗了大量的補(bǔ)體，同時(shí)，細(xì)菌毒素作用于機(jī)體導(dǎo)致各器官功能障礙，使補(bǔ)體合成不足，加上某些病人免疫力低下，造成補(bǔ)體C3水平下降。因此在炎癥初期補(bǔ)體C3水平下降提示機(jī)體感染嚴(yán)重，病人免疫系統(tǒng)有不同程度的損害，如炎癥后期C3水平仍較低，提示炎癥向慢性過(guò)程發(fā)展，并有復(fù)發(fā)趨勢(shì)。

由此可見(jiàn)，在AMI病人中，局部血管炎癥可激活機(jī)體免疫功能，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，導(dǎo)致補(bǔ)體C3水平升高；而在中醫(yī)傳統(tǒng)外科“毒證”病人中，補(bǔ)體消耗過(guò)量、生成不足，可造成補(bǔ)體C3的顯著降低。補(bǔ)體C3類(lèi)似物L(fēng)OC653879可能是CHD“毒證”區(qū)別于傳統(tǒng)外科“毒證”的生物標(biāo)記物之一。

本研究初步篩選到區(qū)別CHD“毒證”和傳統(tǒng)毒證的差異蛋白——補(bǔ)體C3類(lèi)似物L(fēng)OC653879。結(jié)合既往文獻(xiàn)，該蛋白可能是區(qū)別兩組人群的生物標(biāo)記物之一，值得進(jìn)一步研究。

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(本文編輯王雅潔)

Study on Specific Proteins Between Toxin Syndrome in Coronary Heart Disease and Traditional Toxin Syndrome in Surgical Diseases

Xu Jingfeng，Shang Qinghua，Wang Xin，Xu Hao

Xiyuan Hospital，China Acadeny of Chinese Medical Sciences，Bejing 100091，China Corresponding Author:Shang Qinghua

Abstract：ObjectiveTo find the specific proteins between toxin syndrome in coronary heart disease(CHD)and traditional toxin syndrome in surgical diseases．MethodsWe included 30 patients in 2 different groups including acute myocardial infarction(AMI) and traditional toxic syndrome(15 patients in each group).Matrix assisted laser desorption ionization/time-of-flight mass spectroscopy(Maldi-Tof-MS)technology was used to analyze and identify the differential proteins．ResultsFour peptides were found for distinguishing toxin syndrome in CHD and traditional toxin syndrome，peptides significantly higher expression in CHD toxin were 2 022.61Da(LOC653879，similar to complement C3)was identified，and it can distinguish the two group very well．Conclusion Similar to Complement C3 LOC653879 were identified as key protein distinguishing CHD blood-stasis toxin syndrome and traditional toxin syndrome，and it should be studied further．

Key words：coronary heart disease；toxin syndrome；proteomics

基金項(xiàng)目：973計(jì)劃專(zhuān)項(xiàng)課題： 心血管血栓性疾病“瘀毒”病因?qū)W說(shuō)的系統(tǒng)研究(No． 2006CB504803)，國(guó)家自然基金課題：基于蛋白質(zhì)組學(xué)冠心病血瘀證瘀毒病機(jī)轉(zhuǎn)變的生物學(xué)基礎(chǔ)研究(No． 30973702)

通訊作者：尚青華，E-mail：qinghuashang@126.com

中圖分類(lèi)號(hào)：R541R256

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．01．002

文章編號(hào)：1672-1349(2016)01-0004-04

(收稿日期：2015-10-19)

·臨床醫(yī)學(xué)論著·