蔣莉莉，張高原，張建農(nóng)

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

西瓜雜交組合T-1種子純度鑒定的SSR標(biāo)記研究

蔣莉莉，張高原，張建農(nóng)

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

[摘要]【目的】 研究有效的西瓜雜交組合種子純度的SSR標(biāo)記鑒定方法，為室內(nèi)鑒定的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。【方法】 以西瓜雜交組合T-1及其親本自交系P-1、M-13為材料，在子葉展平期采用CTAB法提取DNA，利用優(yōu)化的西瓜SSR標(biāo)記方法進行雜交種子的純度鑒定，并與田間表型鑒定進行比較?！窘Y(jié)果】 從36對SSR引物中篩選出3對(MCPI-5、MCPI-16、MCPI-17)穩(wěn)定性強、可重復(fù)性好、在雜交種及其母本之間具有多態(tài)性的引物。將這3對引物中的MCPI-5和MCPI-16用于267株T-1雜交種群體純度鑒定，顯示種子純度為97.75%，與田間種植鑒定結(jié)果一致?！窘Y(jié)論】 3對SSR引物MCPI-5、MCPI-16和MCPI-17可用于西瓜雜交組合T-1種子純度的室內(nèi)鑒定。

[關(guān)鍵詞]西瓜；雜交種；種子純度；SSR標(biāo)記

在種子生產(chǎn)和銷售之前，對種子的質(zhì)量必須嚴(yán)格檢測把關(guān)，其中種子純度鑒定為最重要的一項。常規(guī)的純度檢測方法為形態(tài)鑒定，即田間種植鑒定法，但是其具有耗時耗力、易受環(huán)境條件及栽培措施影響等缺點。隨著科學(xué)技術(shù)的進步，種子純度鑒定技術(shù)由傳統(tǒng)的田間種植鑒定逐步發(fā)展為生化指紋鑒定和分子標(biāo)記鑒定[1]。西瓜是重要的園藝作物，我國每年種植面積占世界面積的一半以上。而目前生產(chǎn)中推廣的品種幾乎100%都是雜交一代品種，因此，西瓜雜交種子的室內(nèi)快速鑒定是簡化檢測程序、提高檢測效果、保證種子純度的有效技術(shù)措施之一。

在田間種植鑒定中，西瓜種子純度可以根據(jù)葉片的形狀與大小，如板葉、黃化葉等性狀進行初步鑒定，但主要還是依靠果實形狀與皮色進行鑒定，因此進行早期鑒定十分困難。同時，由于一些同類品種在果實的外型與顏色上十分接近，單純依靠表型差異來進行西瓜品種純度與真實性鑒定也有一定的困難，而DNA分子標(biāo)記鑒定是解決上述問題的最有效措施[2]。

利用DNA分子標(biāo)記鑒定種子純度在多種作物上都有一定研究。劉富中等[3]利用RAPD標(biāo)記方法從 80個隨機引物中篩選出5個可進行3個甜瓜雜交種純度鑒定的引物；Truksa等[4]在分析了3個黃瓜親本材料的RAPD 多態(tài)性后發(fā)現(xiàn)黃瓜多態(tài)性差，認(rèn)為RAPD 分析不適于驗證黃瓜雜交種的純度；張穎等[5]利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)，建立了黃瓜品種室內(nèi)分子標(biāo)記遺傳純度鑒定與田間純度鑒定結(jié)果的回歸關(guān)系；歐陽新星等[6]、王鳴剛等[7]利用RAPD標(biāo)記對西瓜種子純度鑒定進行了研究；張紅等[8]利用RAPD、SSR標(biāo)記對甜瓜種子進行純度鑒定研究，認(rèn)為SSR標(biāo)記更適合甜瓜雜交種純度的快速鑒定。從多方面研究結(jié)果來看，RAPD標(biāo)記可能存在重復(fù)性差、易受試驗條件、人為因素影響等缺點，因此更加穩(wěn)定、可靠的標(biāo)記方法研究，以及針對特定品種(或組合)的技術(shù)篩選，有利于該技術(shù)在生產(chǎn)實際中的推廣應(yīng)用。

本試驗以2個西瓜自交系及雜交F1為試驗材料，結(jié)合形態(tài)學(xué)和DNA分子標(biāo)記2種鑒定方法，建立了一套完整的適合供試西瓜品種的室內(nèi)種子純度鑒定體系，以期為其種子純度的室內(nèi)快速鑒定奠定基礎(chǔ)，并為其他西瓜品種種子純度的鑒定提供參考。

1材料與方法

1.1材料

供試材料的母本為西瓜自交系P-1(果皮為綠皮(條紋))，父本為西瓜自交系M-13(果皮為花皮(條斑))，還包括由父母本雜交而得到的F1(組合代號T-1，果皮為花皮(條斑))。

1.2方法

1.2.1田間種植鑒定將T-1及其親本的種子播種于地力、環(huán)境條件一致的地塊中，高畦覆地膜栽培，田間管理同普通大田，親本每個樣本種植50株，F(xiàn)1種植300株，并進行編號。根據(jù)果實皮色鑒別種子純度。

1.2.2室內(nèi)SSR分子鑒定(1)DNA的提取及PCR反應(yīng)程序。采用CTAB法提取西瓜子葉和成熟葉DNA。采用Joobeur等[9]的方法選出36對引物，由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成。

采用降落PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃變性45 s，59～50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共10個循環(huán)，每循環(huán)1次溫度降1 ℃；94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。特定引物擴增采用的PCR程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，退火45 s(退火溫度因引物而定)，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。對擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用銀染法染色。

(2)引物的篩選及穩(wěn)定性檢測。以T-1及其父、母本DNA為模板，對36對SSR引物進行篩選，尋找在母本和F1中具有多態(tài)性的引物，并進行重復(fù)試驗，以驗證引物的穩(wěn)定性和可靠性。

(3)雜交種子純度的SSR鑒定及田間鑒定比較。采集田間鑒定過的F1葉片，編號標(biāo)記，利用上述篩選得到的SSR特異性引物對其進行室內(nèi)鑒定，并將結(jié)果與田間鑒定結(jié)果作比較，檢測是否與田間鑒定結(jié)果相一致。

2結(jié)果與分析

2.1田間種植鑒定

根據(jù)供試材料雜交組合F1及其親本的田間表現(xiàn)，確定果實皮色是鑒定F1與母本差異最可靠的性狀。當(dāng)坐果時節(jié)雌花開放約1周后，果實長到雞蛋大小，果實皮色(花紋)即顯現(xiàn)出來。由于西瓜果實花皮對綠皮為顯性，因此果實表現(xiàn)為花皮，而假雜種則是母本的自交果，表現(xiàn)為綠皮，所以能據(jù)此明確地統(tǒng)計出種子純度。本研究共對正常出苗生長的267株F1進行了統(tǒng)計，其中T-1(雜交一代種子)261株，假雜種6株，種子純度為97.75%(圖1)。

2.2室內(nèi)SSR分子鑒定

2.2.1引物多態(tài)性表現(xiàn)采用36對SSR引物對T-1及其母本葉片DNA進行PCR擴增，從中篩選出在F1與其母本之間具有多態(tài)性差異的引物。圖3結(jié)果顯示，36對引物中有5條SSR引物在F1與母本之間可以擴增出多態(tài)性差異，分別為5/6：MCPI-5；19/20：MCPI-14；23/24：MCPI-16；25/26：MCPI-17和51/52：MCPI-32。其他31對引物在F1與母本之間未擴增出多態(tài)性差異。

圖 1　西瓜 F1(左)與母本(右)果實皮色的差異

圖 3　西瓜F1及其母本部分SSR引物的篩選結(jié)果

2.2.2特異性引物的穩(wěn)定性檢測選出這些在T-1與其母本之間表現(xiàn)出多態(tài)性的引物，以母本、父本和F1代子葉DNA為模板，進行多次擴增，驗證這些引物擴增的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，結(jié)果見圖4。圖4中出現(xiàn)了2種擴增類型，一種是互補類型，即F1代擴增出父母本的互補條帶，這種類型既可以區(qū)分母本，又可以鑒別父本，如引物MCPI-17；另一種為偏父型，只能鑒別母本而不能區(qū)別父本，可以用于鑒別假雜交(母本自交植株)，如MCPI-5、MCPI-14、MCPI-16和MCPI-32。經(jīng)多次擴增，顯示MCPI-5、MCPI-16、MCPI-17 3對引物穩(wěn)定性好，可重復(fù)性強，且非特異性條帶較少，而MCPI-14和MCPI-32 2對引物非特異性條帶太多，鑒定效果較差。

2.2.33對SSR引物對西瓜種子純度的鑒定利用MCPI-5、MCPI-16和MCPI-17 3對引物分別對西瓜雜交組合T-1進行種子純度鑒定，結(jié)果(圖5)顯示，雜交種和假雜種的擴增條帶出現(xiàn)明顯差異，MCPI-5引物清晰地鑒定出假雜種3和13號，MCPI-16鑒定出的假雜種為7號，MCPI-17鑒定出的假雜種為5和12號。3對引物可以達到鑒別真假雜交種的目的。

圖 4　不同引物在西瓜雜交種T-1及其親本之間擴增的穩(wěn)定性檢測

圖 5引物MCPI-5 (A)、MCPI-16 (B)和MCPI-17 (C)對西瓜雜交組合T-1種子純度的檢測結(jié)果

Fig.5Identification of seed purity of watermelon hybrid T-1 based on MCPI-5 (A),MCPI-16 (B) and MCPI-17 (C)

2.2.4西瓜種子純度田間種植鑒定與室內(nèi)SSR鑒定結(jié)果的比較對田間鑒定過的西瓜父本、母本、雜交種和假雜種的葉片統(tǒng)一編號，在實驗室再進行SSR種子純度的重復(fù)鑒定，比較田間調(diào)查結(jié)果與室內(nèi)鑒定結(jié)果的一致性。田間鑒定結(jié)果中假雜種分別為9，42，67，107，175和231號，與實驗室用MCPI-5和MCPI-16 2對引物鑒定的結(jié)果可以對應(yīng)(圖6和圖7為部分鑒定結(jié)果)。田間和室內(nèi)鑒定的假雜種同為6株，種子純度為97.75%，誤差為0，2種鑒定結(jié)果完全一致。

圖 6　引物MCPI-5對西瓜雜交種種子純度的鑒定結(jié)果

圖 7　引物MCPI-16對西瓜雜交種種子純度的鑒定結(jié)果

3討論

在一定隔離條件下的制種地，從母本植株上采得的種子除想得到的F1種子外，就是母本自交種子即假雜種(由于隔離不好，有外來花粉傳入而形成的異株型，或因收獲時機械混雜造成的異品種種子混入另當(dāng)別論，本研究僅涉及在規(guī)范的繁種條件下種子純度的檢驗方法)。因此，種子純度鑒定就是找出母本與F1的差別，然后利用這一差別鑒別出假雜種所占的比例，計算出種子純度。

目前西瓜雜交種子純度鑒定的主要方法仍然是田間鑒定[10]，即利用苗期植株上的差異或開花坐果后幼果的差異進行鑒定[11]。一般苗期鑒定得花費數(shù)周時間，時間的長短依苗期表現(xiàn)性狀出現(xiàn)的遲早而定。該鑒定方法相對果實鑒定法用時短、耗費少(可密植)，但用于鑒定的標(biāo)記性狀太少，僅對少數(shù)品種有效。而利用果實性狀鑒定種子純度是當(dāng)前大多數(shù)西瓜品種鑒定所采用的方法[12]，一般得耗費2個月左右的時間。

雜交種子純度的室內(nèi)鑒定是改進田間鑒定耗時費力等不足的最好方法。研究表明，種子純度的室內(nèi)鑒定可以利用種子貯藏蛋白、同工酶、DNA等的差別來進行[13-15]。李麗等[16]、趙建華[17]、閆鵬[18]曾對西瓜、甜瓜種子貯藏蛋白和同工酶用于種子純度鑒定進行了研究，結(jié)果顯示西瓜種子貯藏蛋白和同工酶差異較小、蛋白質(zhì)條帶不清晰，應(yīng)用于雜交種子純度鑒定的準(zhǔn)確性較為有限。因此，利用DNA分子標(biāo)記鑒定西瓜種子純度成為人們研究的方向。西瓜的遺傳基礎(chǔ)十分狹窄，國內(nèi)育出的很多雜交種的親本材料本身遺傳變異幅度小，不易找到多態(tài)性差異。因此，找到能夠區(qū)分雜交種和父本、母本且具有互補帶型的合適SSR引物至關(guān)重要[19]。

本試驗結(jié)果表明，利用SSR技術(shù)建立種子純度的室內(nèi)檢測方法是可行的，但篩選出來的引物的擴增產(chǎn)物大小比較接近，多重PCR擴增結(jié)果尚不是很理想，所以在進一步的研究中，應(yīng)該篩選一些擴增產(chǎn)物大小相差大、互相之間無影響的引物進行多重PCR擴增。同時，應(yīng)建立一個標(biāo)準(zhǔn)化的檢測程序，主要包括種子DNA提取、特異性引物篩選、多重PCR擴增、聚丙烯酰胺凝膠電泳、凝膠識別軟件對條帶的讀取、數(shù)據(jù)的分析和統(tǒng)計、鑒定結(jié)果的形成等。因此，該技術(shù)在生產(chǎn)中極具應(yīng)用潛力，但尚有待進一步的改進和完善。

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Purity identification of watermelon hybrid combination T-1 seeds using SSR molecular marker

JIANG Li-li,ZHANG Gao-yuan,ZHANG Jian-nong

(CollegeofHorticulture,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu730070,China)

Abstract:【Objective】 SSR molecular marker technique was used to identify purity of watermelon hybrid seeds,aiming to provide a reliable indoor method for purity identification of hybrid seeds.【Method】 Seeds of watermelon hybrid combination T-1 and its parents (P-1,M-13) were selected in this study.DNA was extracted with CTAB method in cotyledon and optimized with SSR molecular marker method.SSR identification results were compared with field identification.【Result】 Three pairs of primers,which were stability,repeatability and polymorphic between hybrids and their parents,were selected from 36 pairs of SSR primers.A total of 267 seedlings of T-1 were identified by MCPI-5 and MCPI-16,the obtained purity was 97.75%,identical to field identification.【Conclusion】 Three pairs of SSR primers (MCPI-5,MCPI-16 and MCPI-17) could be used to identify the seeds purity of T-1.

Key words:watermelon;hybrid seed;purity of seeds;SSR marker

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.014

[收稿日期]2014-10-31

[基金項目]甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項目(GNSW-202-23)

[作者簡介]蔣莉莉(1987-)，女，甘肅榆中人，在讀碩士，主要從事蔬菜育種與種質(zhì)資源利用研究。E-mail：jliabc@163.com [通信作者]張建農(nóng)(1958-)，男，陜西西安人，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事蔬菜育種與種質(zhì)資源利用研究。

[中圖分類號]S651.037

[文獻標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)06-0093-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.028.html