楊俊嶺，高偉，王玨，付榮，陳波，李偉艷，溫樹信，王斌全（1.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科；.耳鼻咽喉頭頸腫瘤山西省重點實驗室，山西醫(yī)科大學耳鼻咽喉研究所；3.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院口腔科）

?

喉癌TU177細胞系中CD133+CD44+腫瘤干細胞分選及特性分析

楊俊嶺1，2，高偉1，2，王玨2，3，付榮2，陳波2，李偉艷2，溫樹信1，2，王斌全1，2
（1.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科；2.耳鼻咽喉頭頸腫瘤山西省重點實驗室，山西醫(yī)科大學耳鼻咽喉研究所；3.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院口腔科）

摘要：目的：免疫磁珠分選喉癌TU177細胞系中的CD133+CD44+細胞，探討CD133+CD44+細胞作為腫瘤干細胞的生物學特性。方法:培養(yǎng)喉癌TU177細胞，采用免疫磁珠分選技術分選CD133+CD44+、CD133+CD44-、CD133-CD44+、CD133-CD44-細胞，流式檢測分選效率，檢測各組細胞的增殖、侵襲、遷移、粘附、克隆形成能力。結(jié)果：CD133+CD44+細胞的增殖、遷移、侵襲、粘附、克隆能力均明顯高于其他組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.0001）。結(jié)論：免疫磁珠技術能有效進行TU177細胞系的分選，CD133+CD44+細胞亞群具有強增殖、侵襲、遷移、粘附、克隆形成能力，具有腫瘤干細胞特征，CD133作為干細胞標志物，其干細胞特性強于CD44，可為喉癌的進一步靶向治療提供依據(jù)。

關鍵詞：喉癌；CD133；CD44；TU177；磁珠分選；腫瘤干細胞

腫瘤干細胞假說提供了腫瘤起始和進展的模型，從這一模型可以得出只有一部分亞群的腫瘤細胞擁有特定保持腫瘤干性的能力［1］。研究表明一部分腫瘤的復發(fā)與轉(zhuǎn)移歸因于腫瘤干細胞，有證據(jù)表明腫瘤干細胞存在于頭頸部腫瘤中，對腫瘤的診斷、預后治療有很大影響。喉腫瘤同樣有一群小部分細胞具有無限增殖、分化和體外克隆的能力，這一小部分細胞是腫瘤的起源細胞，維持整個瘤體的更新和生長，侵襲和遷移，被命名為腫瘤干細胞［2］。我們選用喉鱗癌TU177細胞系，應用細胞表面標志物CD133、CD44將喉癌TU177細胞進行分組篩選，對該細胞群進行干細胞生物學特性的初步探討，為今后喉癌干細胞的分離和鑒定奠定實驗基礎。

1　材料與方法

1.1實驗材料

人喉鱗癌 TU177細胞株來源于耳鼻咽喉頭頸腫瘤山西省重點實驗室，10％小牛血清（美國GIBCO公司）、MEM培養(yǎng)液（美國GIBCO公司）

1.2主要試劑

FITC-CD44抗體及同型對照（美國，BD），PE-CD133抗體及同型對照 、anti-PE multisort kit 、anti-FICT磁珠和 LS 分選柱（德國，Miltenyi）

1.3實驗方法

1.3.1TU177細胞系的培養(yǎng)及篩選

收集對數(shù)期TU177細胞，CD133-PE抗體避光孵育，洗滌，加抗PE磁珠混勻，避光孵育，過柱，陽性收集管中為CD133+細胞標記為A，陰性收集管中為133-細胞標記為B。將得到A組加磁珠剪切劑孵育，洗滌，加停止剪切劑，得到去除磁珠的CD133+細胞標記為C。將得到的B、C組細胞和CD44磁珠孵育，C細胞過柱得到2組細胞為CD44+CD133+、CD44-CD133+，B組細胞過柱得到2組細胞為CD44+CD133-、CD44-CD133-。

1.3.2流式細胞儀檢測細胞純度

1.3.3增殖實驗

細胞計數(shù)，調(diào)整濃度為1×105/ml，每組細胞取100ul，設3個復孔，分別于第1、2、3、4、5天，加CCK-8孵育1小時，450nm測定吸光度值，計算均值。

1.3.4侵襲實驗

細胞計數(shù)儀計數(shù)，調(diào)整濃度為1×105/mL。取基質(zhì)膠包被的transwell小室，下室加含20％FBS 的MEM，上室加200uL細胞，每組3個復孔，培養(yǎng)48小時后取出小室，PBS清洗，甲醛固定，輕擦上室，冰醋酸溶解，測OD值。

1.3.5遷移實驗

同侵襲實驗，用未用基質(zhì)膠包被的小室。

1.3.6克隆形成實驗

細胞計數(shù)，稀釋至300個/mL，置35mm2培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，2周后PBS清洗，甲醛固定，結(jié)晶紫染色，冰醋酸溶解，測OD值。

1.3.7細胞粘附實驗

細胞計數(shù)為1×105個/mL，基質(zhì)膠包被96孔板，每孔加入細胞液100uL，3個復孔，培養(yǎng)1、2、4h后取出，加入CCK-8，檢測450nm波長各孔吸光值。

1.3.8統(tǒng)計學方法-

SPSS22.0進行統(tǒng)計分析。計量資料用x ±s來表示，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1流式結(jié)果

流式結(jié)果顯示分選前CD133表達率為1.5％左右，CD44表達率約為80.6％，使用免疫磁珠分選技術對磁珠進行分選，進行流式檢測，檢測結(jié)果示CD133-CD44-細胞純度達99.52％左右，CD133+CD44+細胞組純度達95.17％左右，如圖1所示。

圖1?。ˋ）TU177；（B）CD133-CD44+；（C）CD133+CD44+；（D）CD133-CD44-

2.2增殖實驗結(jié)果

如圖2所示。

2.3遷移、侵襲、粘附、克隆實驗結(jié)果

CD133+CD44+細胞遷移、侵襲、粘附、克隆數(shù)多于其它組細胞，CD133+CD44-細胞遷移、侵襲、粘附、克隆數(shù)大于CD133-CD44+細胞、CD133-CD44-細胞和TU177細胞，組間兩兩比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.00O1）。實驗結(jié)果見表1。

圖2　細胞增殖曲線

3　討論

喉鱗癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）源于喉黏膜上皮，居頭頸部鱗癌第2位，約占全身惡性腫瘤6％。世界范圍內(nèi)喉鱗癌發(fā)病略有上升，且年輕化趨勢逐漸顯現(xiàn)［ 3］。喉鱗癌目前主要治療方式以手術為主，輔以放療，但其對放化療敏感性較差。近30年來喉鱗癌5年生存率仍未有明顯提升，患者一旦發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其生存率降低一半，是其5年內(nèi)死亡的主要原因［4］。由于這些原因，進一步闡明喉癌的發(fā)病機制及其發(fā)病的生物學原因顯的越來越重要。大量研究表明，腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復發(fā)和耐藥等與腫瘤中的腫瘤干細胞有關。Zhou等研究認為，CD133可以作為喉癌干細胞標志物［5］。于丹［6］等認為CD44可以作為喉癌的特異性標志物。本研究中，我們聯(lián)合CD133、CD44兩個干細胞表面標志物，運用免疫磁珠分選技術對喉癌TU177細胞進行分組篩選，進行體外增殖、侵襲、遷移、粘附等能力分析。

表1　TU177、CD133+CD44+、CD133+CD44-、CD133-CD44+、CD133-CD44-遷移實驗、侵襲實驗、粘附實驗、克隆實驗的OD值

在細胞增殖實驗中，CD133+CD44+細胞組增殖速度最快，第3天已經(jīng)達到相對80％融合度，CD133+CD44-增殖數(shù)大于TU177、CD133-CD44+、CD133-CD44-組細胞。在細胞增殖方面我們也可以得出干細胞標志物CD133要強于CD44。

許多研究者認為，腫瘤干細胞具有較強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。我們的研究結(jié)果表明，CD133+CD44+細胞確實具有更強的侵襲和遷移能力。通過細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)CD133+44+細胞增殖能力也明顯更強。粘附實驗中發(fā)現(xiàn)，CD133+44+細胞在1小時內(nèi)就可以迅速貼壁。克隆形成結(jié)果也提示，CD133+44+細胞具有更強的集落形成能力。所有這些特征都符合腫瘤干細胞的生物學特性。我們通過侵襲、遷移、粘附、克隆等實驗的相互論證，更進一步證實了CD133+CD44+亞群細胞具有干細胞特性。綜上所述，CD133+CD44+細胞組具有侵襲能力強、遷移快、粘附快、克隆能力強、增殖能力強等腫瘤干細胞特點，這兩種細胞表面標志物可能作為喉腫瘤靶向治療的靶點。但是實驗中我們也發(fā)現(xiàn)，CD133-CD44-的細胞組也具有較弱的侵襲、遷移、克隆等能力，所以我們相信還有其他的干細胞標志物未被我們發(fā)現(xiàn)。因此，我們還需要進一步的研究、探討。

參考文獻

［1］ Monroe，M.M.，et al.，Cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma.J Oncol.2011；2011:762-780.

［2］C.T.Jordan，M.L.Guzman，andM.Noble.Cancer stem cells.New England Journal of Medicine，2006，355（12）:1253-1261.

［3］ Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013.CA Cancer J Clin.2013，63（1）:11-30.

［4］Stransky N，Egloff AM，Tward AD，et al.The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma.Science.2011.333（6046）:1157-60.

［5］Zhou L，Wei X，Cheng L，Tian J，Jiang JJ.CD133，one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line.Laryngoscope.2007 Mar；117（3）:455-60.

［6］ 于丹，金春順，趙胤，等，CD44+喉癌細胞的干細胞生物學特性初步研究.中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志.2008，43：845-850.

Biological Characteristics of CD133+CD44+Cancer Stem Cells Sorting from Laryngeal Carcinoma Cell Line TU177

YANG Jun-ling1，2， GAO Wei1，2， WANG Jue2， FU Rong2， CHEN Bo2， LI Wei-yan2， WEN Shu-xin1，2， WANG Bin-quan1，2
（1.Department of Otolaryngology， Head & Neck Surgery， No.1 Hospital， Shanxi Medical University， Taiyuan， Shanxi，China.2.Shanxi Key Laboratory of Otorhinolaryngology Head and Neck Cancer， Key Institute and Laboratory of Otolaryngology affiliated with Shanxi Province， Taiyuan， Shanxi， China； 3.Department of Stomatology， No.1 Hospital，Shanxi Medical University， Taiyuan， Shanxi， China）

Abstract:Objective :Magnetic activated cell sorting was used to separate CD133+CD44+ cancer cells from laryngeal carcinoma TU177 cell line.Analysis the biological characteristics of these subpopulations .Methods :TU177 cells were subjected to magnetic activated cell sorting to obtain CD133+CD44+、CD133+CD44-、CD133-CD44+、CD133-CD44-cells.Evaluate the efficiency of magnetic separation by flow cytometry .Test cell proliferation，migration，invasion，adhesion，colony forming ability of the cells.Results:CD133+CD44+cells show higher proliferation，migration，invasion，adhesion，clone ability than other group（P＜0.0001）.Conclusions:TU177 cells can be serparated by Magnetic activated cell sorting effectively.CD133 is more powerful than CD44.Our study may provide evidence for target treatment of laryngeal cancer.

Keywords:Laryngeal cancer；CD133；CD44；TU177；Magnetic activated cell sorting ；Cancer stem cell

*基金項目：山西省基礎研究計劃自然科學基金（2014011039-5），山西省青年科技研究基金（2015021198），山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院青年創(chuàng)新基金（YC1402）

作者簡介：楊俊嶺，男，山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院耳鼻咽喉科學碩士研究生在讀，研究方向為頭頸部惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移

通訊作者：王斌全