陳夢(mèng)揚(yáng)，姚澤秀，李永春，吳涵韜，徐秋芳，魏　健，秦　華（.浙江農(nóng)林大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院/浙江省土壤污染生物修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 臨安　3300；.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 3300）

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雷竹林土壤染料降解真菌篩選與脫色效果初步研究

陳夢(mèng)揚(yáng)1，姚澤秀1，李永春1，吳涵韜2，徐秋芳1，魏健1，秦華1
（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院/浙江省土壤污染生物修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 臨安311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300）

摘要：應(yīng)用平板分離培養(yǎng)和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacers，ITS）序列分析的方法，篩選鑒定集約栽培雷竹Phyllostachys violascens林土壤中染料降解真菌菌株，并通過(guò)搖瓶發(fā)酵研究其染料脫色效果。結(jié)果表明：土壤樣品中分離頻次最高的真菌種類為木霉菌屬Trichoderma，對(duì)5株接種到苯胺藍(lán)平板上能形成明顯水解圈的真菌分離物，測(cè)試它們對(duì)偶氮和三苯甲烷類染料的降解能力。綜合脫色效果較好的菌株為P7-2-3和P12-2-4，ITS序列比對(duì)和形態(tài)學(xué)觀察表明菌株分別是卷枝毛霉Mucor circinelloides和木霉菌Trichoderma sp.，接種不超過(guò)500.0 mg·L-1質(zhì)量濃度結(jié)晶紫染料液體發(fā)酵脫色均可獲得較高的脫色率；但染料質(zhì)量濃度為300.0 mg·L-1和400.0 mg·L-1時(shí)分別對(duì)2菌株的脫色能力產(chǎn)生明顯抑制，降解染料質(zhì)量與菌絲生物量之間存在顯著的正相關(guān)性。圖4表2參31

關(guān)鍵詞：土壤學(xué)；土壤真菌；染料降解；篩選；雷竹林；脫色效果

浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，33（3）：418-426

Journal of ZheJiang A&F University

雷竹Phyllostachys violascens是中國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)廣泛分布的優(yōu)良筍用竹種，自20世紀(jì)90年代初以來(lái)，以冬季覆蓋和大量施肥為主要特征的集約栽培技術(shù)已在生產(chǎn)上大面積推廣［1］。長(zhǎng)期集約栽培導(dǎo)致土壤pH值大幅下降、養(yǎng)分比例失調(diào)、酶活性異常、土壤微生物量碳和微生物區(qū)系發(fā)生改變等［2］。林地覆蓋竹林由于環(huán)境條件的改變，尤其是土壤溫度的變化和有機(jī)覆蓋物及其腐解過(guò)程的吸引集聚作用，也使土壤真菌數(shù)量與比例明顯提高［3-4］。真菌是土壤中重要的微生物資源，在分解纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、果膠及還原氮、溶解磷等生態(tài)過(guò)程中起重要作用。土壤真菌有著形態(tài)、基因以及功能上的多樣性，且無(wú)法在地理上劃分界限，因此，土壤真菌的研究對(duì)調(diào)查方法的依賴更大［5］。長(zhǎng)期覆蓋雷竹林地高碳氮比的有機(jī)覆蓋物輸入，有利于分解木質(zhì)素纖維素能力強(qiáng)的微生物富集［6］。合成染料廣泛應(yīng)用于紡織印染和皮革處理等行業(yè)，由于能夠抵抗光、水、許多化合物和生物攻擊，很難被常規(guī)污水處理系統(tǒng)中的微生物所分解［7］。如果印染廢水不加以處理就直接排放到河流，勢(shì)必造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。許多物理和化學(xué)方法雖然可以從廢水中獲得較好的染料脫色效果，但價(jià)格昂貴、需要耗費(fèi)大量的能源，并且常常產(chǎn)生一些有毒的分解產(chǎn)物等，從而大大限制了這些方法在工業(yè)印染廢水處理中的實(shí)際應(yīng)用［8］。生物學(xué)方法去除染料顏色跟物理化學(xué)方法相比，有許多優(yōu)勢(shì)，比如成本低、生態(tài)友好等［9］。近年來(lái)，陸續(xù)報(bào)道了一些細(xì)菌、真菌能夠去除不同種類染料的顏色［10-13］。細(xì)菌在無(wú)氧的條件下脫色通常只能去除一種類型的偶氮染料，同時(shí)又常常產(chǎn)生一些有害的分解產(chǎn)物，這些不利因素限制了細(xì)菌在處理混合種類染料工業(yè)廢水中的應(yīng)用。因此，越來(lái)越多的研究人員把注意力投向了真菌脫色研究，人們也已經(jīng)從單一的研究白腐真菌開(kāi)始轉(zhuǎn)向?qū)Ω鄻拥拿撋婢难芯浚?4-16］。包括白腐真菌、霉菌、酵母菌等大批真菌，業(yè)已被發(fā)掘出來(lái)用于染料的脫色與降解［17］。真菌降解染料主要是由于其具有非特異性和非選擇性的胞外酶系［12］。白腐真菌是目前研究最多、染料脫色過(guò)程中最有效的真菌資源，其菌絲體靠降解木質(zhì)素—纖維素材料的能力穿入木質(zhì)細(xì)胞腔內(nèi)，釋放的木質(zhì)素降解酶系為非底物專一性酶，分泌到細(xì)胞外對(duì)多種木質(zhì)素成分和染料具有廣譜的氧化降解作用［18］。由于合成染料的結(jié)構(gòu)與木質(zhì)素組分的結(jié)構(gòu)相似，具有分解木質(zhì)素能力的微生物同樣具有分解染料的能力［9］。目前，已有從雷竹林土壤中分離并篩選到分解合成染料［6］和纖維素降解真菌［19］的報(bào)道，但前述研究中僅限于在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分解染料測(cè)試或只測(cè)定酶活性，對(duì)雷竹林土壤染料降解真菌的篩選特別是脫色效果的研究報(bào)道較少。為此，本研究以不同種植年限的雷竹林土壤為材料，采用基于平板分離培養(yǎng)和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacers，ITS）序列分析的方法，解析雷竹林土壤真菌種群特征并篩選染料降解功能菌株，通過(guò)搖瓶發(fā)酵發(fā)掘具有染料脫色潛力的真菌資源，為印染廢水的微生物降解奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1土壤樣品采集

土壤樣品采自浙江省臨安市太湖源鎮(zhèn)（30°16′N, 119°34′E）。土壤為粉砂巖母質(zhì)上發(fā)育的紅壤土類。在研究區(qū)內(nèi)選擇立地條件基本一致，栽培歷史分別為1，7，12，15 a的雷竹林樣地。集約栽培模式為：雷竹定植后的第1～5年基本不施肥或施少量復(fù)合肥，從雷竹栽培的第6年起開(kāi)始實(shí)施集約栽培；每年11月下旬至12月上旬在雷竹林地表先覆蓋15.0 cm稻草作為發(fā)酵增溫層，再覆蓋20.0 cm的礱糠作為保溫層以利于竹筍早發(fā)。自然出筍時(shí)撤去上層的覆蓋物礱糠，而下層的稻草則已基本腐爛入土。不同年份雷竹林隨機(jī)選取3個(gè)經(jīng)營(yíng)措施一致的重復(fù)樣地，共建立12個(gè)20.0 m×20.0 m的樣地，各個(gè)樣地用五點(diǎn)取樣法采集0～20.0 cm土壤樣品。同一樣地新鮮土樣充分混勻后，去除大的石塊和植物殘?bào)w，過(guò)2.0 mm鋼篩后形成1個(gè)混合樣品，共計(jì)12個(gè)土樣裝入密封袋，放入冰桶帶回實(shí)驗(yàn)室。采集樣品分為2份，1份冷藏于4℃用于真菌分離等；另外1份于室內(nèi)自然風(fēng)干，研磨過(guò)篩后用于土壤基本理化性質(zhì)分析。土壤pH值采用水浸提酸度計(jì)法［m（土）：m（水）=1.0：2.5］；土壤有機(jī)碳用重鉻酸鉀外加熱法測(cè)定；土壤全氮采用凱氏定氮法測(cè)定；有效磷采用Bray法測(cè)定；速效鉀先用乙酸銨浸提，后在火焰光度計(jì)上測(cè)定［20］；土壤粒徑分布用比重計(jì)法［21］。不同栽培年限雷竹林土壤的基本理化性質(zhì)如表1。

表1 不同栽培年限雷竹林土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Soil physical and chemical properties of Phyllostachys violascens stand with different culture years

1.2土壤真菌的分離

采用稀釋平皿法［22］在孟加拉紅培養(yǎng)基上分離真菌。取10.0 g新鮮土壤樣品加入到100.0 mL滅菌去離子水中，225 r·min-1，30 min搖勻倍比稀釋制成土壤稀釋液，吸取0.1 mL梯度稀釋液（10-1～10-5）涂布于孟加拉紅固體培養(yǎng)基上，3次重復(fù)，置于28℃避光培養(yǎng)5～7 d。培養(yǎng)過(guò)程中及時(shí)觀察，挑取形態(tài)學(xué)特征不一致的單菌落接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）固體培養(yǎng)基上純化，真菌形態(tài)學(xué)特征鑒別依據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》。純化后的真菌定期轉(zhuǎn)接于PDA平板上，4℃保藏備用。

1.3真菌種屬特征鑒定

ITS分子鑒定具體過(guò)程參照Schoch等［23］的方法，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增引物為：ITS5：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，ITS4：5′- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物利用pMD 18-T載體進(jìn)行克隆后測(cè)序（上海生工），將得到的序列輸入GenBank，與已收錄的真菌基因序列進(jìn)行序列比對(duì)（BLAST）比較，找出其最高相似性序列。利用ClustalX軟件對(duì)供試菌株和參比菌株先進(jìn)行ITS基因的多序列對(duì)齊，再利用Mega 4.0軟件，采用鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。分離真菌ITS序列的GenBank登錄號(hào)為KP027644-KP027648。

1.4真菌脫色能力測(cè)試

使用打孔器（直徑6.0 mm）沿真菌菌絲（菌落）邊緣打孔，取直徑6.0 mm的菌片接種到含有100.0 mg·L-1苯胺藍(lán)的PDA固體培養(yǎng)基上，28℃避光培養(yǎng)觀察各分離菌的脫色能力。能形成明顯水解圈的真菌接種于含有100.0 mg·L-1其他染料（剛果紅、橙黃G、結(jié)晶紫、酸性品紅、甲基橙）的PDA固體培養(yǎng)基上，進(jìn)一步觀察對(duì)其他染料的脫色能力。對(duì)脫色染料的種類較多、能力較強(qiáng)的真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒別及ITS序列分子鑒定，并用于后續(xù)的脫色效果研究。

1.5不同的染料濃度對(duì)真菌脫色效果的影響

向250.0 mL錐形瓶中加入100.0 mL纖維素鈉-結(jié)晶紫液體培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，培養(yǎng)基具體配方為：磷酸二氫鉀（KH2PO4）1.0 g；氯化鈉（NaCl）0.1 g；七水合硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.3 g；硝酸鈉（NaNO3）2.5 g；氯化鐵（FeCl3）0.01 g；氯化鈣（CaCl2）0.1 g；結(jié)晶紫質(zhì)量濃度梯度為0，100.0，200.0，300.0，400.0，500.0 mg·L-1共6個(gè)；每個(gè)結(jié)晶紫梯度的培養(yǎng)基最后用雙蒸水（ddH2O）定容至1 000.0 mL。用棉塞和牛皮紙封裝，121℃高溫高壓滅菌后備用。將篩選出的菌株平板培養(yǎng)4.0 d后，刮取培養(yǎng)皿中的菌絲放入無(wú)菌水中勻漿（3次，6～8 s·次-1），接種液體培養(yǎng)基，接種量為10.0 mL?？瞻讓?duì)照加入10.0 mL無(wú)菌水，不接菌。置于28℃，140 r·min-1振蕩培養(yǎng)8.0 d，每天取樣并檢測(cè)各處理的吸光度D（λ）變化。繪制結(jié)晶紫的吸光度—質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，將記錄的吸光度D（λ）值換算為相應(yīng)濃度，統(tǒng)計(jì)一定時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)基中染料的濃度變化，同時(shí)觀察菌體的生長(zhǎng)情況。將每次檢測(cè)樣品的初始吸光度D （λ）值依照標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成濃度c0，終濃度為c1，按如下公式計(jì)算脫色率。染料脫色率=［（c0-c1）/c0］× 100%。

菌絲生物量測(cè)定參照袁海生等［13］的方法，在吸光度測(cè)量結(jié)束后，將培養(yǎng)液過(guò)濾并用蒸餾水沖洗數(shù)次，真空抽濾后放至烘箱烘干（140℃，100 min）至恒量，稱量即為菌絲生物量。

2　結(jié)果與分析

2.1竹林土壤真菌分離物的基本種屬特征

依據(jù)分離出真菌菌落的顏色、生長(zhǎng)速度、孢子形態(tài)等特征，從竹林土壤中共分離得到形態(tài)特征明顯不同的真菌分離物61株。將各真菌分離物歸類后提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增獲得約550～650 bp的ITS序列，通過(guò)BLAST比對(duì)進(jìn)行初步的種屬鑒定。結(jié)果表明：與真菌分離物ITS序列最為相似的種屬，分別為木霉屬Trichoderma sp.，綠木霉T. virens，T. crassum，棘孢木霉T. asperellum，鉤狀木霉T. hamatum，Hypocrea flaviconidia，Hypocrea cordyceps，黑酵母菌Aureobasidium pullulans，真菌1種，卷枝毛霉Mucor circinelloides等，分屬于半知菌亞門(mén)Deuteromycotina，子囊菌亞門(mén)Ascomycotina和接合菌亞門(mén)Zygomycotina。

2.2染料脫色真菌篩選

將上述真菌分離物以平皿培養(yǎng)的方式，接種到苯胺藍(lán)培養(yǎng)基上進(jìn)行初步篩選，發(fā)現(xiàn)有5株真菌分離物能形成明顯的水解圈。進(jìn)一步測(cè)試這5株真菌對(duì)5種結(jié)構(gòu)不同的合成染料—?jiǎng)偣t/橙黃G（偶氮類）、結(jié)晶紫/酸性品紅（三苯甲烷）、甲基橙等的分解能力。在固體培養(yǎng)基上，該5株分離物對(duì)結(jié)晶紫、橙黃G、剛果紅、甲基橙脫色能力和速度均有差異（表2）。對(duì)3種不同類型共5種合成染料脫色效果表明：5株真菌分離物對(duì)酸性品紅脫色效果最好，其次是結(jié)晶紫，對(duì)剛果紅、橙黃G和甲基橙脫色能力一般。由于結(jié)晶紫和酸性品紅同屬三苯甲烷類染料，說(shuō)明這5株真菌分離物對(duì)三苯甲烷類染料有較好的脫色效果，但這些菌株起初篩選時(shí)接種到苯胺藍(lán)培養(yǎng)基上都能形成明顯的水解圈，也表明真菌脫色效果與生長(zhǎng)時(shí)間有一定關(guān)系。

表2 5株真菌分離物對(duì)合成染料的脫色效果Table 2 Decolorization screening of synthetic dyes by five isolate fungi in agar media

2.3脫色真菌分子種屬鑒定

上述5株真菌分離物ITS序列BLAST比對(duì)結(jié)果表明：分離物P7-2-1，P7-2-3，P12-2-4分別與黑酵母菌Aureobasidium pullulans，卷枝毛霉Mucor circinelloides，木霉菌屬Trichoderma sp.相似度最高，相似度為99%～100%；而P7-2-2和P1-2-2與真菌1種相似度較高，分別為97%和90%。

根據(jù)上述基因序列比對(duì)的結(jié)果，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了8個(gè)參比菌株的序列，得到反映待測(cè)真菌菌株與參比菌株之間進(jìn)化與發(fā)育關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）。由ITS序列所構(gòu)成的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，P7-2-1，P7-2-3，P12-2-4與黑酵母菌、卷枝毛霉、木霉菌屬位于同一個(gè)進(jìn)化枝上，結(jié)合形態(tài)鑒定結(jié)果，該3株真菌可分別鑒定為黑酵母菌、卷枝毛霉菌、木霉菌屬。而P7-2-2和P1-2-2菌株自身相似性較高，與草酸青霉菌Penicillium oxalicum親緣關(guān)系相對(duì)較近，但分子種屬特性不夠明確尚需進(jìn)一步鑒定，由此也暗示集約經(jīng)營(yíng)雷竹林土壤具有挖掘染料降解真菌資源的潛力。

2.4染料質(zhì)量濃度對(duì)菌株脫色效果的影響

基于5株真菌分離物對(duì)合成染料脫色的效果，選擇綜合脫色能力較好的菌株P(guān)7-2-3和P12-2-4（圖2），分別接種到不同質(zhì)量濃度梯度結(jié)晶紫染料中進(jìn)行液體發(fā)酵脫色研究。菌株P(guān)7-2-3接種10.5 d內(nèi)染料的脫色效果如圖3所示，接種4.5 d后，100.0 mg·L-1和200.0 mg·L-1質(zhì)量濃度的脫色率明顯高于其余3個(gè)濃度梯度，且100.0 mg·L-1和500.0 mg·L-1等2個(gè)質(zhì)量濃度的脫色率基本趨于穩(wěn)定（圖3a），顯示低質(zhì)量濃度染料條件下菌株呈現(xiàn)出較高的脫色率的趨勢(shì)。接種10.5 d后菌株P(guān)7-2-3對(duì)100.0 mg·L-1和200.0 mg·L-1質(zhì)量濃度梯度結(jié)晶紫染料的脫色率分別為94.1%和83.0%，而對(duì)300 mg·L-1，400 mg·L-1和500 mg·L-1質(zhì)量濃度的脫色率分別只達(dá)到46.0%，41.0%和33.0%左右。由此可見(jiàn)：結(jié)晶紫染料質(zhì)量濃度達(dá)到300.0 mg·L-1以上時(shí)對(duì)菌株P(guān)7-2-3的脫色能力起到明顯的抑制作用，而質(zhì)量濃度低于200.0 mg·L-1時(shí)其抑制作用并不明顯。

圖1 部分分離真菌菌株ITS序列及其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 1 Phylogenetic tree of isolate fungi and reference strains based upon aligned sequences of ITS sequence

圖2 P7-2-3和P12-2-4菌株對(duì)5種合成染料（100.0 mg·L-1）的脫色效果Figure 2 Decolorization effect of synthetic dyes（100.0 mg·L-1）by P7-2-3 and P12-2-4

圖3 菌株P(guān)7-2-3（a）和P12-2-4（b）對(duì)不同質(zhì)量濃度結(jié)晶紫的脫色率Figure 3 Decolorizing rate of crystal violet with different concentrations by P7-2-3（a）and P12-2-4（b）

菌株P(guān)12-2-4對(duì)不同質(zhì)量濃度梯度的結(jié)晶紫染料脫色率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，接種4.5 d時(shí)對(duì)不同質(zhì)量濃度梯度染料的脫色率表現(xiàn)出與菌株P(guān)7-2-3相似的趨勢(shì)；但接種6.0 d后300.0 mg·L-1質(zhì)量濃度梯度的染料脫色率隨培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)而不斷提高，并在接種9.0 d時(shí)與200.0 mg·L-1質(zhì)量濃度的脫色率接近，雖然接種10.5 d時(shí)脫色率略高于200.0 mg·L-1質(zhì)量濃度的處理但并無(wú)顯著差異（圖3b）。接種10.5 d后P12-2-4菌株對(duì)100.0，200.0和300.0 mg·L-1等3個(gè)質(zhì)量濃度結(jié)晶紫染料脫色率分別達(dá)到88.1%，78.8% 和82.0%，但對(duì)400.0 mg·L-1和500.0 mg·L-1質(zhì)量濃度的染料脫色率分別只達(dá)到47.3%和44.3%，可見(jiàn)結(jié)晶紫染料濃度達(dá)到400.0 mg·L-1以上對(duì)菌株P(guān)12-2-4的脫色能力起到明顯的抑制作用。

2.5染料脫色效果與菌絲生物量的關(guān)系

上述菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)10.5 d后，對(duì)不同結(jié)晶紫染料質(zhì)量濃度下的菌絲生物量進(jìn)行測(cè)定，染料脫色率與菌株P(guān)7-2-3，P12-2-4生物量的關(guān)系如圖4所示。菌株P(guān)7-2-3經(jīng)過(guò)10.5 d培養(yǎng)后脫色率隨結(jié)晶紫質(zhì)量濃度增加而下降（圖4a），菌絲生物量則呈現(xiàn)一定程度的上升。菌株P(guān)12-2-4經(jīng)過(guò)10.5 d培養(yǎng)后脫色率在結(jié)晶紫濃度達(dá)到400.0 mg·L-1后明顯下降（圖4b），而菌絲生物量在染料質(zhì)量濃度達(dá)到300.0 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大。為準(zhǔn)確描述染料不同質(zhì)量濃度下菌株脫色效果與菌絲生物量之間的關(guān)系，計(jì)算了每個(gè)質(zhì)量濃度下最終降解結(jié)晶紫染料的總質(zhì)量，并與對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度下菌絲生物量進(jìn)行相關(guān)分析表明，菌株P(guān)7-2-3降解染料質(zhì)量與對(duì)應(yīng)菌絲生物量之間Pearson相關(guān)系數(shù)為0.972（P＜0.01, n=15），而菌株P(guān)12-2-4兩者之間Pearson相關(guān)系數(shù)為0.983（P＜0.01, n=15），表明菌株降解結(jié)晶紫的質(zhì)量與菌絲生物量之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。

圖4 不同質(zhì)量濃度下結(jié)晶紫降解率與菌株P(guān)7-2-3（a）及P12-2-4（b）生物量的關(guān)系Figure 4 Dye-decolorizing rate of P7-2-3（a）, P12-2-4（b）and its biomass under different concentration of crystal violet

3　討論

長(zhǎng)期林地覆蓋經(jīng)營(yíng)勢(shì)必導(dǎo)致雷竹林表層土壤酸化和主要養(yǎng)分的過(guò)量積累，真菌數(shù)量總體上隨林地覆蓋年限的增加呈顯著升高趨勢(shì)［4］。而富含纖維素和木質(zhì)素且高碳氮比的有機(jī)覆蓋物，留存于雷竹林土壤中短期內(nèi)難以自然腐解，也是導(dǎo)致林地土壤發(fā)生物理、化學(xué)和生物性劣變的重要原因之一［19］。本研究采集了4個(gè)年份的雷竹林表層土壤，理化性質(zhì)分析表明，土壤pH隨栽培年限的增加而顯著下降，土壤有機(jī)碳、全氮、有效磷和速效鉀隨栽培年限延長(zhǎng)而顯著增加，同時(shí)集約栽培4 a（12 a）和10 a（15 a）后土壤碳氮比顯著提高，印證了前人的研究結(jié)果。通過(guò)對(duì)真菌分離物初步的形態(tài)分類和分子種屬鑒定表明，分離頻次最高的真菌種類為木霉菌屬。木霉菌屬真菌廣泛分布于土壤、植物根際、腐爛的木材和其他基質(zhì)中，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)［24］，易于分離純化和培養(yǎng)，可利用各種簡(jiǎn)單或復(fù)雜的碳源和氮源生長(zhǎng)繁殖［25］。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)木霉屬真菌功能的研究表明，木霉可產(chǎn)生拮抗物質(zhì)和溶菌酶從而抑制其他病原菌的生長(zhǎng)，還可產(chǎn)生纖維素酶和其他水解酶類［26-27］。長(zhǎng)期覆蓋經(jīng)營(yíng)雷竹林有機(jī)覆蓋物殘留和表層土壤碳氮比顯著提高，也為篩選具有高效降解能力的真菌菌株奠定了基礎(chǔ)。

微生物在自然界的纖維素降解過(guò)程中起關(guān)鍵和主要作用，其中真菌的貢獻(xiàn)最大，典型代表有木霉屬Trichoderma sp.［28］和青霉屬Penicillium sp.［29］等。本研究對(duì)分離、純化得到的真菌分離物進(jìn)行降解合成染料的功能篩選。結(jié)果表明：5株真菌對(duì)3類共5種染料脫色能力和速度有所差異，對(duì)同屬三苯甲烷類的酸性品紅和結(jié)晶紫有較好的脫色效果。經(jīng)形態(tài)與基于ITS序列的分子鑒定結(jié)果表明：對(duì)5種染料綜合脫色效果較好的P7-2-3和P12-2-4菌株分別為卷枝毛霉菌Mucor circinelloides，木霉菌Trichoderma sp.。黨宏波等［30］從大慶油田長(zhǎng)期被石油污染的土壤中，分離出具有高效原油降解能力的絲狀真菌卷枝毛霉菌。而以雷竹林覆蓋材料礱糠、稻草及覆蓋雷竹林土壤為材料，韓國(guó)民等［6］分離并篩選到1株冷杉附毛孔菌Trichaptum abietinum，該真菌能夠在固體培養(yǎng)基上分解所測(cè)試的全部9種合成染料。可曉等［19］分離出1株濾紙酶活力高的菌株，經(jīng)菌落培養(yǎng)特征和顯微結(jié)構(gòu)特征觀察屬青霉屬Penicillium，可見(jiàn)長(zhǎng)期覆蓋經(jīng)營(yíng)林地中的高效降解真菌具有多樣性。系統(tǒng)發(fā)育分析表明：菌株P(guān)7-2-2和P1-2-2與草酸青霉菌Penicillium oxalicum親緣關(guān)系相對(duì)較近，但其種屬特性需要進(jìn)一步鑒定。已有的研究表明：草酸青霉菌作為絲狀真菌，對(duì)染料具有高效吸附作用［31］，也為進(jìn)一步深入發(fā)掘特定竹林生境中具有高效生物降解潛力的有益真菌提供了科學(xué)依據(jù)。

為定量驗(yàn)證所篩選到菌株的脫色能力，選擇在培養(yǎng)平皿上對(duì)5種染料綜合脫色能力較好的菌株P(guān)7-2-3和P12-2-4，進(jìn)行10.5 d內(nèi)不同質(zhì)量濃度結(jié)晶紫染料液體發(fā)酵脫色研究。結(jié)果表明：菌株P(guān)7-2-3和P12-2-4分別接種200.0 mg·L-1和300.0 mg·L-1結(jié)晶紫染料，搖瓶10.5 d后脫色率分別可以達(dá)到83.0%和82.0%；而染料質(zhì)量濃度分別達(dá)到300.0 mg·L-1和400.0 mg·L-1以上時(shí)，此2株菌的脫色能力明顯被抑制。由此可見(jiàn)：結(jié)晶紫染料質(zhì)量濃度對(duì)菌株P(guān)12-2-4抑制作用相對(duì)稍弱，也證實(shí)其脫色能力比菌株P(guān)7-2-3更強(qiáng)。相關(guān)分析表明：不同質(zhì)量濃度下菌株降解結(jié)晶紫的總質(zhì)量與菌絲生物量存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，這也證實(shí)了袁海生等［13］菌絲生物量與脫色率具有明顯正相關(guān)性的結(jié)論。本研究中菌株對(duì)不同質(zhì)量濃度結(jié)晶紫染料的脫色效果與菌絲生物量之間的關(guān)系，也說(shuō)明培養(yǎng)基中染料過(guò)多是導(dǎo)致真菌對(duì)高質(zhì)量濃度染料脫色率降低的原因之一?？梢酝ㄟ^(guò)增加液體發(fā)酵脫色染料的種類和優(yōu)化脫色條件等，將篩選獲得菌株應(yīng)用于環(huán)保廢水處理等環(huán)保產(chǎn)業(yè)。

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Decolorizing synthetic dyes with fungi screened from a Phyllostachys violascens stand

CHEN Mengyang1, YAO Zexiu1, LI Yongchun1, WU Hantao2, XU Qiufang1, WEI Jian1, QIN Hua1
（1. Key Laboratory of Soil Contamination Bioremediation of Zhejiang Province, School of Environmental and Resource Sciences, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, Zhejiang, China；2. School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, Zhejiang, China）

Abstract:This study aimed to screen high efficiency decolorizing fungi for degradation of structurally different synthetic dyes. Fungal strains were isolated and screened from soil of bamboo plantation（Phyllostachys violascens）using conventional separation, cultivation methods, and sequence alignment analysis of nuclear ribosomal internal transcribed spacers（ITS）. The bamboo plantation for isolating soil fungi consisted of bamboo forests aged 1, 7, 12, and 15 years, which applied no heavy fertilization and organic mulch until year 5. Result showed that Trichoderma sp. had the highest isolation frequency in the cultured fungi from topsoil based on morphological identification and phylogenetic analysis. Decolorization capacity of the five isolated fungi（（P7-2-1, P7-2-2, P1-2-2, P7-2-3, P12-2-4）to the five different synthetic dyes（Congo red, orange G, crystal violet, fuchsin acid, and methyl orange）showed that P7-2-3（identified as Mucor circinelloides）and P12-2-4（identified as Trichoderma spp.）had the strongest capacity to decolorize the five kinds of dyes. The decolorization efficiency of P7-2-3 and P12-2-4 to crystal violet was similar at different crystal violet concentrations below 500.0 mg·L-1；however, crystal violet inhibited the decolonization reaction at concentrations of 300.0 mg·L-1for strain P7-2-3 and 400.0 mg·L-1for strain P12-2-4. The fungal biomass and dye decolorization had a positive relationship for different concentrations of crystal violet, and strains of P7-2-3 and P12-2-4 have potential value for applicationin decolorization and degradation of dyes wastewater.［Ch, 4 fig. 2 tab. 31 ref.］

Key Words:soil science；soil fungi；dyes decolorization；screen；Phyllostachys violascens stand；decolorizing effect

中圖分類號(hào)：S718.8

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-0756（2016）03-0418-09

doi：10.11833/j.issn.2095-0756.2016.03.007

收稿日期：2015-06-03；修回日期：2015-11-30

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31200473）；浙江省教育廳資助項(xiàng)目（Y201225759）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201410341015）

作者簡(jiǎn)介：陳夢(mèng)揚(yáng)，從事土壤微生物學(xué)研究。E-mail：ChenMY1993@126.com。通信作者：李永春，副教授，博士，從事土壤與環(huán)境微生物學(xué)研究。E-mail：ycli@zafu.edu.cn