翁　賢翁　嘉（.廣東省中醫(yī)院　廣州　5005；.惠州市食品藥品檢驗(yàn)所　惠州　5600）

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間苯二酚苯酚洗劑微生物限度檢查方法研究

翁賢1翁嘉2（1.廣東省中醫(yī)院廣州510105；2.惠州市食品藥品檢驗(yàn)所惠州516001）

摘要：目的：建立對(duì)間苯二酚苯酚洗劑進(jìn)行微生物限度檢查的方法。方法：采用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法對(duì)細(xì)菌、霉菌及酵母菌進(jìn)行回收率試驗(yàn)和方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果：培養(yǎng)基稀釋法對(duì)各菌的菌回收率均高于70%；控制菌驗(yàn)證試驗(yàn)中試驗(yàn)組結(jié)果均為陽(yáng)性。結(jié)論：間苯二酚經(jīng)稀釋后抑菌活性可消除。采用培養(yǎng)基稀釋法對(duì)間苯二酚苯酚洗劑的細(xì)菌、霉菌及酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)和控制菌檢查，試驗(yàn)結(jié)果符合要求。建立的方法簡(jiǎn)便、可行、有效，可作為間苯二酚苯酚洗劑制劑的微生物限度檢查方法。

關(guān)鍵詞：間苯二酚苯酚洗劑微生物限度檢查培養(yǎng)基稀釋法間苯二酚方法驗(yàn)證

間苯二酚苯酚洗劑是用于治療淺部真菌感染，如手足癬、體癬、股癬等的一種制劑。制劑中含有間苯二酚，間苯二酚是酚類衍生物的一種，屬常用酚類消毒劑。然而在常溫下，以間苯二酚800mg/L、1200mg/L、600mg/L的水溶液作用10min，分別對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的殺滅率均達(dá)100%［1］。因此，對(duì)于間苯二酚苯酚洗劑，進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，必須重點(diǎn)考慮如何消除間苯二酚本身抑菌性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。筆者建立了有效的微生物限度檢查法，并對(duì)間苯二酚苯酚洗劑的微生物限度檢查進(jìn)行了方法驗(yàn)證。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，改良馬丁培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，膽鹽乳糖培養(yǎng)基，pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2驗(yàn)證用菌株：大腸埃希菌（菌種編號(hào)：［CMCC（B）44 102］；來(lái)源：廣東省食品藥品檢驗(yàn)所）；金黃色葡萄球菌（菌種編號(hào)：［CMCC（B）26 003］；來(lái)源：廣東省食品藥品檢驗(yàn)所）；枯草芽孢桿菌（菌種編號(hào)：［CMCC（B）63 501］；來(lái)源：廣東省食品藥品檢驗(yàn)所）；白色念珠菌（菌種編號(hào)：［CMCC（F）98 001］；來(lái)源：廣東省食品藥品檢驗(yàn)所）；銅綠假單胞菌（菌種編號(hào)：［CMCC（B）10 104］；來(lái)源：廣東省食品藥品檢驗(yàn)所）；黑曲霉（菌種編號(hào)：［CMCC（F）98 003］；來(lái)源：深圳市藥品檢驗(yàn)所）。

2　菌液制備［2?。?/h2>

2.1細(xì)菌菌液制備：大腸埃希菌：取第三代凍存管，放至室溫解凍，接種至含營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，36.0℃條件下培養(yǎng)24h；然后將培養(yǎng)物稀釋105倍，即得實(shí)驗(yàn)用菌懸液。

金黃色葡萄球菌：取第三代凍存管，放至室溫解凍，接種至含營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，36.0℃條件下培養(yǎng)24h；然后將培養(yǎng)物稀釋107倍，即得實(shí)驗(yàn)用菌懸液。

枯草芽孢桿菌：取第三代凍存管，放至室溫解凍，接種至含營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，36.0℃條件下培養(yǎng)24h；然后將培養(yǎng)物稀釋106倍，即得實(shí)驗(yàn)用菌懸液。

銅綠假單胞菌：取第三代凍存管，放至室溫解凍，接種至含營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，36.0℃條件下培養(yǎng)24h；然后將培養(yǎng)物稀釋107倍，即得實(shí)驗(yàn)用菌懸液。

注：稀釋介質(zhì)用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液；實(shí)驗(yàn)用菌懸液要求濃度為每1mL 50～100cfu。

2.2霉菌菌液制備：取第三代凍存管，放至室溫解凍，接種至含改良馬丁培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，26.5℃條件下培養(yǎng)48h；培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋106倍，即得實(shí)驗(yàn)用菌懸液，濃度為每1mL 50～100cfu。

2.3酵母菌菌液制備：取第三代凍存管，放至室溫解凍，接種至含改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，26.5℃條件下培養(yǎng)5d后，加入3mL的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液（含0.05%吐溫80），把斜面上的孢子洗脫下來(lái)。然后，用無(wú)菌吸管（管口帶薄無(wú)菌棉花）將洗脫液吸至無(wú)菌試管中，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液將洗脫液稀釋105倍，即得濃度為每1mL含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。

3　供試液的制備

間苯二酚苯酚洗劑（批號(hào)：011020）：由惠州市皮膚病防治研究所提供。取本品10mL，加入90mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，混勻，即得供試液。

4　預(yù)實(shí)驗(yàn)［3?。?/h2>

用常規(guī)法對(duì)間苯二酚苯酚洗劑進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)間苯二酚苯酚對(duì)枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌，白色念珠菌有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)黑曲霉抑制作用較弱。因此選擇培養(yǎng)基稀釋法再進(jìn)行試驗(yàn)。

5　驗(yàn)證試驗(yàn)

5.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：

5.1.1試驗(yàn)條件：細(xì)菌用計(jì)數(shù)方法進(jìn)行驗(yàn)證：驗(yàn)證菌株為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及枯草芽孢桿菌，細(xì)菌培養(yǎng)溫度為32.5℃。

霉菌及酵母菌用計(jì)數(shù)方法進(jìn)行驗(yàn)證：驗(yàn)證菌株為白色念珠菌、黑曲霉，培養(yǎng)溫度為26.5℃。

在確定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的驗(yàn)證方法后，重復(fù)三次獨(dú)立平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，考察各組菌的回收率。

5.1.2試驗(yàn)分組與步驟（如表1）：

試驗(yàn)組：各取供試液0.2mL、0.5mL置平皿（90mm）中，分別加入1mL菌懸液。立即注入相同體積的瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，將平皿倒置，再培養(yǎng)24h，記錄下各平皿的菌落數(shù)，做兩次平行試驗(yàn)。

菌液組：取1mL菌懸液加入平皿，立即注入瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，將平皿倒置，再培養(yǎng)24h，記錄下各平皿的菌落數(shù)，做兩次平行試驗(yàn)。

供試液對(duì)照組：各取供試液0.2mL、0.5mL，不加菌液，其他操作條件同試驗(yàn)組，記錄樣品本底菌落數(shù)。

5.1.3計(jì)算各試驗(yàn)菌株的回收率：記錄各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)，然后按照以下方法進(jìn)行計(jì)算：

菌株回收率（%）=［（試驗(yàn)組-供試液對(duì)照組）/菌液組］× 100%。各試驗(yàn)菌株的回收率如表1、表2。

表1　各菌株回收率（%）培養(yǎng)基稀釋法（0.5mL/皿）

表2　各菌株回收率（%）培養(yǎng)基稀釋法（0.2mL/皿）

5.1.4試驗(yàn)結(jié)果：表1、2數(shù)據(jù)表明，采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2mL/皿），大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌3次平行試驗(yàn)的回收率均達(dá)到70%以上。采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5mL/皿），白色念珠菌和黑曲霉3次平行試驗(yàn)的回收率也均達(dá)到70%以上。因此，可采用0.2mL/皿的培養(yǎng)基稀釋法，檢查間苯二酚苯酚洗劑的細(xì)菌數(shù)；可采用0.5mL/皿的培養(yǎng)基稀釋法，檢查霉菌及酵母菌數(shù)。

5.2控制菌檢查法的驗(yàn)證：間苯二酚苯酚洗劑為局部給藥制劑，藥典的控制菌檢查要求檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌［2］。

5.2.1金黃色葡萄球菌檢查法的驗(yàn)證：常規(guī)法：取供試液10mL，加入100mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)基中，再加入1mL金黃色葡萄球菌菌懸液，按金黃色葡萄球菌的檢查法，進(jìn)行控制菌檢查。

培養(yǎng)基稀釋法：取供試液10mL，加入200mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)基中，再加入1mL金黃色葡萄球菌菌懸液，按金黃色葡萄球菌的檢查法，進(jìn)行控制菌檢查。

結(jié)果見(jiàn)表3。

5.2.2銅綠假單胞菌檢查法的驗(yàn)證：常規(guī)法：取供試液10mL，加入100mL的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，再加入1mL銅綠假單胞菌菌懸液，按銅綠假單胞菌的檢查法，進(jìn)行控制菌檢查。

培養(yǎng)基稀釋法：取供試液10mL，加入200mL的膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，再加入1mL銅綠假單胞菌菌懸液，按銅綠假單胞菌的檢查法，進(jìn)行控制菌檢查。

結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　控制菌驗(yàn)證結(jié)果

5.2.3試驗(yàn)結(jié)果：表3數(shù)據(jù)表明，兩種菌的培養(yǎng)基稀釋組均檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，表明間苯二酚苯酚洗劑可用培養(yǎng)基稀釋法（200mL）進(jìn)行控制菌檢查。

6　討論

本研究采用培養(yǎng)基稀釋法探討間苯二酚苯酚洗液多個(gè)濃度對(duì)細(xì)菌、霉菌及酵母菌限度檢查。從實(shí)驗(yàn)回收率數(shù)據(jù)分析得，間苯二酚苯酚洗劑細(xì)菌計(jì)數(shù)可采用0.2mL/皿的培養(yǎng)基稀釋法，霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)可采用0.5mL/皿的培養(yǎng)基稀釋法。間苯二酚苯酚洗劑可用培養(yǎng)基稀釋法（200mL）進(jìn)行控制菌檢查驗(yàn)證，該實(shí)驗(yàn)方法合理簡(jiǎn)便。因此本方法可以作為間苯二酚苯酚洗劑的微生物限度檢查法。

參考文獻(xiàn)

［1］劉繼敏，趙勇，高貴軍.間苯二酚消毒劑殺菌效果觀察［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2005，22（3）：309.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部［S］.2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄107-116.

［3］林麗英，湛文清，饒春意.野牡丹止痢片微生物限度檢查法的建立［J］.中藥材，2006，29（3）：299-302.

Method research of microbial limit test in resorcinol phenol lotion

Xian Weng1Jia Weng2（1.Guangdong Province Hospital of TCM，Guangdong，Guangzhou 510105；2.Food and Drug Administration of Huizhou District，Guangdong 516001）

Abstract：Objective：To establish a method for resorcinol phenol lotion microbial limit test. Methods：Used the conventional microbial species method and the medium dilution microbial species detecting method by test the recovery of each test strains. Results：The recoveries were more than 70%by culture medium diluting method. Pathogenic bacteria in the test group to verify the test results were positive. Conclusion：Resorcinol can eliminate their antibacterial activity after dilution. Culture medium diluting method was used with counts bacterial，mold and yeasts，pathogenic bacteria test. The test results meet the requirements. The method is simple，effective and feasible and can be used for microbial limit test of Resorcinol phenol lotion.

Key words：Resorcinol phenol lotion Microbial limit test Culture medium diluting method Resorcinol Method verification.

中圖分類號(hào)：R927.11

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1672-8351（2016）06-0124-02