侯 爍，朱承廣，趙 強，向小華，程亞增，閆杏杏， 蔣彩虹，程立銳，楊愛國，王元英*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島 266109；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點實驗室，青島 266101)

一種苗期鑒定煙草赤星病抗性的新方法

侯 爍1,2，朱承廣2，趙 強2，向小華2，程亞增2，閆杏杏2， 蔣彩虹2，程立銳2，楊愛國2，王元英2*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島 266109；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點實驗室，青島 266101)

煙草赤星病抗性的高通量鑒定是快速篩選和培育煙草抗赤星病品種的前提條件。以15份對赤星病表現(xiàn)不同抗性水平的煙草種質(zhì)為材料，采用鏈格孢菌菌餅接種苗期離體葉片，以發(fā)病葉片病斑面積作為抗性評價指標，對15份煙草種質(zhì)的抗性進行評價，并與其田間成株期赤星病抗性進行比較分析。結(jié)果表明，采用苗期菌餅接種，供試15份煙草種質(zhì)的病斑面積差異顯著，感病品種病斑平均面積明顯大于抗病品種；各品種苗期赤星病鑒定結(jié)果與成株期抗性鑒定結(jié)果基本一致，且苗期病斑面積大小與3個不同年份、同一地點的成株期平均病級指數(shù)間相關(guān)性均達到顯著水平，分別為0.78、0.74和0.66。表明本研究探討的苗期離體葉片菌餅鑒定法可以用于煙草赤星病早期鑒定，病斑面積可以作為評價指標準確反映不同煙草品種間赤星病的抗性差異。

赤星病；離體鑒定；病斑；病級指數(shù)

煙草赤星病是一類由鏈格孢菌引起的煙株成熟后期病害，其主要危害煙草葉片，影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。由于煙草赤星病的發(fā)病條件受溫度、濕度等環(huán)境因素影響較大，使得煙草赤星病的接種鑒定成為一個難題。因此，建立一個在可控條件下快速準確的鑒定方法十分必要。首先科學(xué)的接種鑒定株都能發(fā)病且接種后病原菌要處于相對一致的有利于發(fā)病環(huán)境當中；二是科學(xué)的調(diào)查標準與適時的病情調(diào)查，調(diào)查標準可靠，主觀誤差盡可能小，病情調(diào)查時期適當[2]。目前，針對煙草赤星病抗性接種鑒定主要有3種方法：田間鑒定法[3]、離體葉片鑒定法[4-5]和毒素鑒定法[6-7]。為了克服大田鑒定周期長以及鑒定結(jié)果受溫、濕度等環(huán)境因素影響大的缺點[8]，本研究在總結(jié)前人的研究基礎(chǔ)上，探討了一種苗期鑒定煙草赤星病抗性的新方法，為快速高通量篩選和培育煙草赤星病抗病品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

15份供試煙草種質(zhì)來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所國家煙草種質(zhì)資源中期庫（表1）。其中包括8份選育烤煙種質(zhì)，4份引進烤煙種質(zhì)，2份地方烤煙種質(zhì)和1份引進雪茄煙種質(zhì)。根據(jù)煙草品種資源信息，這15份煙草種質(zhì)對赤星病的抗性各異，其中凈葉黃和Beinhart1000-1是煙草赤星病抗病育種工作中利用的主要抗源。供試煙草種質(zhì)均采用1% AgNO3溶液浸泡10 min滅菌后使用。

供試煙草赤星病菌株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙草植物保護研究中心提供，為強致病力鏈格孢菌菌株。

1.2 試驗方法

1.2.1 育苗及田間種植 煙草赤星病苗期鑒定材料于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所即墨農(nóng)場溫室中進行育苗，將種子播種于假植盤中，覆膜保濕，出苗后揭去保鮮膜，20 d左右每個品種選取50棵健壯幼苗假植于50孔育穴盤中，進行苗期常規(guī)管理。40 d左右每份種質(zhì)選取4棵生長健康、長勢一致的煙苗移栽至小花盆中，置于溫度為28 ℃，空氣相對濕度為65%的人工氣候室中生長。

煙草赤星病成株期田間鑒定材料育苗方法同上，2013、2014和2015年均在5月上旬移栽至農(nóng)場大田，每個品種移栽1行形成一個小區(qū)，每行5株，行距1.2 m，株距0.55 m。常規(guī)水肥管理。

1.2.2 苗期煙草赤星病接種鑒定方法 （1）葉片選?。簾熋缫圃灾列』ㄅ韬?，待煙株長至5～7葉期時從每株頂部往下選取第3或4片完全展開的葉片（圖1A），葉片用濕潤棉花包住葉柄處保濕，置于鋪有濾紙的濕潤海綿上，將海綿置于盛有600 mL蒸餾水，長×寬×高=2 cm×15 cm×8 cm的保鮮盒中。

（2）病原菌活化：將鏈格孢菌在PDA培養(yǎng)基上進行活化，于黑暗條件下28 ℃培養(yǎng)3～4 d。

（3）接種鑒定：采用5 mm打孔器沿菌落邊緣打取含白色菌絲的菌餅若干備用（圖1B）。每片煙葉背面沿主脈對稱接種4個菌餅，白色菌絲面朝下（圖1C），每片煙葉為一個重復(fù)，共3次重復(fù)。接菌完畢后將保鮮盒置于溫度為28 ℃，光/暗周期為16 h/8 h條件下人工氣候室培養(yǎng)，保鮮盒內(nèi)濕度保持在90%左右（圖1D）。5 d后測量和統(tǒng)計病斑圓形面積（圖1E）。

1.2.3 田間煙草赤星病接種鑒定方法 （1）孢子懸浮液制備方法：煙草赤星病菌于PDA培養(yǎng)基上于28 ℃，黑暗條件下進行活化。待菌落鋪滿整個培 養(yǎng)皿后，進行分生孢子濃度檢測，分生孢子濃度約為3×106個/mL時用于接種。按無菌水：分生孢子=50:1的重量比配制成孢子懸浮液備用。

表1 16份煙草種質(zhì)Table 1 The 16 tobacco germplasms

圖1 煙草赤星病接種流程Fig. 1 Tobacco brown spot inoculation process

（2）孢子懸浮液濃度計算方法：移液槍移取5 mL無菌水注入培養(yǎng)皿，用載玻片刮取菌落，洗脫過濾菌絲。用移液槍移取1 mL洗脫液注入血球計數(shù)板的凹槽至凹槽滿。顯微鏡觀察計數(shù)（20×），計數(shù)時讀取雙線格中菌數(shù)，共計25格。孢子懸浮液濃度計算方法如下：

10000×稀釋倍數(shù) （此試驗稀釋倍數(shù)為5）

（3）田間病級調(diào)查：大田煙株長至9～10葉時利用劃傷懸滴接種法接種兩片底部葉，套袋保濕，3周后調(diào)查發(fā)病情況。煙草赤星病分級標準按照煙草病蟲害分級及調(diào)查方法（GBT23222—2008），以葉片為標準分級調(diào)查，共劃分為6個標準：0級，全葉無?。?級，病斑面積占葉片面積1%以下；3級，病斑面積占葉片面積2%～5%；5級，病斑面積占葉片面積6%～10%；7級，病斑面積占葉片面積11%～20%；9級，病斑面積占葉片面積21%以上。

病級指數(shù)=100×∑（代表數(shù)值×病級葉數(shù)）/（葉 片總和×發(fā)病最終病級代表數(shù)值）

抗性評價：免疫，病情指數(shù)等于0；高抗，0＜病情指數(shù)≤30；中抗，30＜病情指數(shù)≤50；中感，50＜病情指數(shù)≤70；高感，70＜病情指數(shù)≤100。 1.2.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)、圖表處理及統(tǒng)計分析在Microsoft Excel 2003中進行，方差分析采用SPSS軟件處理。

2 結(jié) 果

2.1 苗期離體葉片赤星病抗性鑒定結(jié)果

使用菌餅接種煙草苗期離體葉片，5 d后進行表型變化觀察。結(jié)果表明，抗病品種葉片被侵染部位形成較小的病斑（圖2a），感病品種被侵染部位形成較大的病斑，葉片褪綠變黃現(xiàn)象嚴重（圖2b）。接種后5 d進行病斑面積測量統(tǒng)計和方差分析，供試煙草品種間病斑平均面積多重比較結(jié)果顯示（表2），15份煙草種質(zhì)病斑平均面積差異顯著，病斑平均面積最大為127.58 mm2，最小為7.21 mm2，根據(jù)病斑平均面積對15份供試煙草種質(zhì)進行赤星病抗性劃分，NC82、C151和小黃金1025表現(xiàn)為高度感??；大柳條和NC89表現(xiàn)為中度感??；長脖黃和革新三號表現(xiàn)為中度抗??；凈葉黃、K326、SpeightG-28、9201、紅花大金元、Beinhart1000-1、單育二號和潘圓黃表現(xiàn)為高度抗病。

圖2 不同煙草品種接種后5 d病癥Fig. 2 Disease symptoms of tobacco 5 days after inoculation

表2 不同煙草品種病斑平均面積多重比較Table 2 The multiple comparison for average lesion area of different tobacco varieties

2.2 田間赤星病抗性鑒定

使用劃傷懸滴法接種大田煙草葉片，將接種葉片套袋保濕，3周后進行病級調(diào)查統(tǒng)計，2013、2014、2015年病級統(tǒng)計分析結(jié)果表明（表3），C151、小黃金1025、大柳條、紅花大金元、K326、長脖黃、潘圓黃、和凈葉黃9個品種抗性表現(xiàn)相對穩(wěn)定。其中，C151和小黃金1025三年抗性鑒定結(jié)果均表現(xiàn)為高度感??；大柳條、紅花大金元和K326三年抗性鑒定結(jié)果均表現(xiàn)為中度感??；長脖黃3年抗性鑒定結(jié)果均表現(xiàn)為中度抗??；潘圓黃和凈葉黃3年抗性鑒定結(jié)果均表現(xiàn)為高度抗病。NC89、NC82、革新三號、9201、SpeightG-28、單育二號和Beinhart1000-1七個品種各年份間抗性表現(xiàn)并不都相同。綜合3年抗性鑒定結(jié)果可知，NC89和NC82表現(xiàn)為高度感病；革新三號、9201和SpeightG-28表現(xiàn)為中度抗?。粏斡柡虰einhart1000-1表現(xiàn)為高度抗病。

煙草赤星病苗期鑒定與大田鑒定比較結(jié)果顯示，苗期和大田期鑒定結(jié)果中NC82、C151和小黃金1025均表現(xiàn)為高度感??；大柳條均表現(xiàn)為中度感病，長脖黃、革新三號均表現(xiàn)為中度抗病，凈葉黃、Beinhart1000-1、單育二號和潘圓黃均表現(xiàn)為高度抗病，SpeightG-28、NC89和9201苗期與大田期抗感趨勢表現(xiàn)一致。說明苗期離體葉片菌餅鑒定法的鑒定結(jié)果較為可靠，該法可用于煙草赤星病抗病品種的初步鑒定與篩選。

表3 不同煙草品種田間赤星病抗性鑒定Table 3 Evaluation of different tobacco resistance to brown spot disease in the field

2.3 相關(guān)分析驗證

使用SPSS軟件進行苗期病斑平均面積與大田病情指數(shù)間相關(guān)分析，結(jié)果表明，苗期病斑平均面積與2013、2014和2015年大田病情指數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.78、0.74和0.66，均達極顯著水平（表4），進一步說明苗期病斑面積可以作為赤星病抗性的評價指標。

表4 苗期病斑平均面積與田間病情指間數(shù)相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficients between average lesion area in stage and average disease rating in the filed

3 討 論

前人在煙草赤星病抗性鑒定方面進行了較多探索和研究。孢子懸浮液和AT毒素是進行赤星病接種鑒定最常用的兩種介質(zhì)，無論苗期還是成株期兩種物質(zhì)都能夠用來接種。孢子懸浮液制備比較簡單，接種濃度可控，但接種后發(fā)病慢，發(fā)病情況受孢子懸浮液濃度和溫、濕度等環(huán)境條件影響較大[9]；AT毒素活性強，接種后發(fā)病快，但AT毒素的提取和純化過程復(fù)雜[10-11]。因此，在煙草赤星病抗性鑒定過程中，大多數(shù)研究者選擇分生孢子懸浮液作為接種物質(zhì)。

針對煙草赤星病的接種鑒定，研究者通常在實驗室和大田兩種環(huán)境中進行。大田鑒定通常以成熟期葉片為接種對象，采用劃傷接種或直接噴施孢子懸浮液的方法進行接種鑒定，鑒定結(jié)果準確性較高，但其周期長，工作量大[12]。實驗室鑒定方法多種多樣，有毒素培養(yǎng)基法、毒素浸根法、離體葉片鑒定法等[6-7]，本研究在總結(jié)前人基礎(chǔ)上，采用鏈格孢菌菌餅接種苗期離體葉片進行赤星病抗性評價，與大田鑒定相比，菌餅制備和接種方法比孢子懸浮液簡便，發(fā)病相對較快，周期短，省時省力，且溫、濕度可控，不受季節(jié)限制，受環(huán)境影響小。但與其他方法相比，本研究的離體葉片菌餅鑒定法也有不足之處，下一步可增加病害發(fā)生和侵染過程中一些調(diào)查指標，如病斑形成的快慢和侵染后是否造成葉片衰老變黃等，以便對不同種質(zhì)赤星病抗性做出更為全面、客觀的評價。

本研究采用的苗期離體葉片菌餅鑒定法對不同煙草種質(zhì)進行赤星病抗性早期鑒定，為開展煙草赤星病抗病育種和抗病分子機制研究奠定了基礎(chǔ)。

[1] 張萬良，翟爭光，謝楊軍，等. 煙草赤星病研究進展[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，23（1）：118-120.

[2] 王子斌. 水稻紋枯病接種鑒定體系新探索及抗病新種質(zhì)YSBR1抗性分析[D]. 揚州：揚州大學(xué)，2013.

[3] 蔣彩虹，馮全福，王元英，等. 一個與凈葉黃抗赤星病基因緊密連鎖的SSR標記[J]. 中國煙草科學(xué)，2012，33（1）：19-22.

[4] Elena T Y, Zhenya P Y, Slavtcho S. Alternaria alternata AT toxin induce programmed cell death[J]. Phytopathol, 2009, 157: 592-601.

[5] Sun H, Wang L, Zhang B. Scopoletin is a phytoalexin against Alternaria alternata in wild tobacco dependent on jasmonate signalling[J]. Journal of Experimental Botany, 2014, 15: 4305-4315.

[6] 郭永峰. 煙草赤星病抗性鑒定的新方法—毒素抗性鑒定法[J]. 中國煙草，1995（3）：44-47.

[7] 孫麗萍. 煙草突變體抗赤星病快速高通量篩選鑒定方法研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.

[8] 張亞，何可佳，羅坤，等. 煙草赤星病研究進展及對策[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（2）：82-84.

[9] 劉化冰，張小全，楊鐵釗，等. 煙草赤星病抗病性鑒定方法研究進展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2009（21）：261-265.

[10] 吳中心，姚根懷，張同慶，等. 煙草赤星病抗性鑒定方法的研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，1994（6）：15-17.

[11] 李梅云. Na鹽與AT毒素對煙苗根生長的影響[J]. 中國煙草學(xué)報，2006，12（5）：43-45.

[12] 巢進，田茂成，黃遠斌，等. 煙草不同品種赤星病抗性鑒定[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（17）：136-138.

A New Method to Evaluate Tobacco Resistance to Brown Spot Disease at the Seedling Stage

HOU Shuo1,2, ZHU Chengguang2, ZHAO Qiang2, XIANG Xiaohua2, CHENG Yazeng2, YAN Xingxing2, JIANG Caihong2, CHENG Lirui2, YANG Aiguo2, WANG Yuanying2*

（1. Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2. Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory for Tobacco Gene Resources, Qingdao 266101, China)

High-throughput resistance evaluation in vitro is important for the screening and breeding of tobacco varieties resistant to tobacco brown spot disease. In this study, detached leaves at the seedling stage of 15 tobacco germplasm materials with different resistance to tobacco brown spot disease were inoculated with plugs of Alternaria alternata. The lesion area was used to evaluate the disease resistance of the 15 tobacco germplasm materials after inoculation, and the tobacco resistance identified at the seedling stage was compared with that at the adult stage in the field. The results showed that the lesion areas of 15 tobacco varieties were significantly different after inoculation, and the lesion areas of the susceptible varieties was obviously larger than that of the resistant varieties. The resistance identified at the seedling stage and at the adult stage was similar. At the same location with three years’ field experiments, the correlation coefficients between lesion areas and disease indexes were 0.78, 0.74 and 0.66, all at a significant level. In conclusion, this method of inoculation of fungal plugs on detached seedling leaves can be used to effectively evaluate the resistance of tobacco varieties to brown spot disease at early stages, and lesion area can be taken as an index to accurately indicate the resistance of different tobacco varieties to brown spot disease.

tobacco brown spot; resistance evaluation in vitro; lesion; disease index

S435.72

1007-5119（2016）06-0072-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.06.013

國家煙草專賣局煙草基因組計劃重大專項項目“煙草抗CMV和赤星病連鎖分子標記開發(fā)及NC82、K326品種抗性改良”（110201301009）

侯 爍（1990-），男，在讀碩士研究生，研究方向：作物遺傳育種。E-mail：15165235159@163.com。*通信作者，E-mail：wangyuanying@caas.cn

2016-05-16

2016-08-28