汪漢成，薛娟娟，黃艷飛，王茂勝，張長青

（1.貴州省煙草科學研究院，貴陽 550081；2.長江大學農(nóng)學院，湖北 荊州 434025）

煙草赤星病菌嘧菌酯抗性突變體的誘導及其生物學特性

汪漢成1，薛娟娟2，黃艷飛2，王茂勝1，張長青2

（1.貴州省煙草科學研究院，貴陽 550081；2.長江大學農(nóng)學院，湖北 荊州 434025）

為探究煙草赤星病菌對嘧菌酯的抗藥性風險水平，通過對煙草赤星病菌在室內(nèi)含藥平板上的菌絲藥劑馴服和分生孢子紫外誘變，進行突變體的生物學特性的研究，并對突變體靶標基因細胞色素b進行了測序分析。獲得了4株嘧菌酯抗藥性突變體。其中，菌絲藥劑馴服未獲得突變體；孢子紫外誘變獲得4株突變體，突變率約為0.004%，突變體抗性倍數(shù)分別為42.50、282.50、515和107.50。4株突變體均降低了對嘧菌酯的敏感性。適合度研究表明，抗藥性突變體具有同敏感菌株同樣的分生孢子萌發(fā)能力和致病能力；菌絲生長速率較敏感菌株有所降低，3株突變體的分生孢子產(chǎn)量較敏感菌株增強，1株突變體較敏感菌株減弱?？顾幮园谢蚣毎豣基因部分序列分析表明，突變體在129位和143位的堿基與敏感菌株完全相同，未發(fā)生任何突變。初步認為煙草赤星病菌對嘧菌酯的抗性風險水平較低。

嘧菌酯；抗藥性；煙草赤星病菌；甲氧基丙烯酸酯；突變體

烤煙（Nicotiana tabacum L.）是我國重要的經(jīng)濟作物，其在我國的產(chǎn)量和消費量均占全球約40% 左右[1-2]。由Alternaria alternata（Frises）Keissler引起的煙草赤星病是煙草生長中后期發(fā)生最為嚴重的葉部病害之一，導致煙葉品質(zhì)下降，烘烤價值降低[3-5]。該病害具有間歇性和爆發(fā)性的特點，嚴重時煙葉發(fā)病率可高達90%，重病區(qū)減產(chǎn)、減收達50%以上[6-7]。長期以來，煙草赤星病嚴重威脅我國煙草的生產(chǎn)。目前，我國主要采用菌核凈（dimetachlone）來防治煙草赤星病，長期高頻率的應用已使病原菌群體出現(xiàn)了嚴重的抗藥性[8]，亟待尋找新的替代防治藥劑，并對新藥劑的抗藥性風險進行評估。近年來，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑陸續(xù)在我國登記，用于多種鏈格孢屬真菌病害的防治[9-12]。

嘧菌酯（azoxystrobin）是甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的典型代表。它由瑞士先正達公司研制開發(fā)，并于2001開始在中國登記。它通過與細胞色素bcl復合物中Qo位點結(jié)合，切斷呼吸鏈中的電子傳遞，抑制真菌細胞能量產(chǎn)生，干擾呼吸，從而抑制菌絲生長和孢子萌發(fā)[13-15]。嘧菌酯在開發(fā)和研究早期，被認為具有中等抗藥性風險[16]；但實際上，在它應用2年后，就出現(xiàn)了防治效果下降的現(xiàn)象。目前，被報道對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的鏈格孢屬病原菌有鏈格孢菌（A.alternata），極細鏈格孢菌（Alternaria tenuissima），茄鏈格孢（Alternaria solani）和蘋果褐斑病菌（Alternaria mali）[9,11,17]。嘧菌酯在歐美被用于赤星病的防治，目前還沒有發(fā)現(xiàn)煙草赤星病菌對它產(chǎn)生抗藥性的報道。煙草赤星病菌是否對嘧菌酯存在抗藥性風險目前仍不清楚。

藥劑高選擇壓下病原菌突變體的誘導和其生物學習性的研究是評價病原菌抗藥性風險的重要方法。為了更好地防治病害，就必須進行病原菌對其防治藥劑產(chǎn)生抗藥性的風險評估。本文以煙草赤星病菌敏感性菌株為對象，進行嘧菌酯抗藥性突變體的誘導及突變體的生物學習性的研究，旨在評價煙草赤星病菌對嘧菌酯產(chǎn)生抗藥性的風險水平。

1 材料與方法

1.1 病原菌及培養(yǎng)條件

野生敏感煙草赤星病菌菌株C2-1，由貴州省煙草科學研究院微生物實驗室分離和鑒定，用于嘧菌酯抗藥性突變體誘導。馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）用于病原菌的培養(yǎng)及保存。AEA培養(yǎng)基：5 g酵母、6 g NaNO3、6 g KH2PO4、0.5 g KCl、0.25 g MgSO4、20 mL甘油及15 g瓊脂，加去離子水定容至1 L，滅菌，用于敏感性測定及分生孢子的誘導。

1.2 供試藥劑

93%嘧菌酯由先正達（中國）有限公司提供，溶于甲醇配成10 000 mg/L的母液。旁路氧化途徑抑制劑水楊肟酸（SHAM，99%）由美國Acros Organics公司生產(chǎn)，溶于甲醇配成1.0×105mg/L的母液。用無菌水將上述母液稀釋成系列濃度的藥液，于4 ℃黑暗條件下保存、備用。藥液中甲醇的含量小于待測溶液體積的0.5%，此濃度的甲醇不影響煙草赤星病菌分生孢子的萌發(fā)（數(shù)據(jù)略）。以加入相同體積的甲醇處理作為空白對照。

1.3 抗藥性突變體的誘導

紫外誘變：將敏感菌株C2-1于PDA平板上預培養(yǎng)4 d，在菌落邊緣制備菌碟（5 mm），將菌碟置于AEA平板上，25 ℃培養(yǎng)7 d后，無菌水洗滌孢子，獲得分生孢子懸液，并將孢子濃度調(diào)至1.0×105個/mL，備用。制備嘧菌酯100 mg/L的含藥平板，吸取100 μL的分生孢子懸液涂布于平板上，預培養(yǎng)2 h后，將平板置于紫外燈下（40 W，垂直距離15 cm）照射20 min，照射后的平板置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d。從長出的菌落邊緣挑取少量菌絲繼續(xù)培養(yǎng)，直至產(chǎn)孢，收集分生孢子并將其涂布于嘧菌酯100 mg/L的含藥平板進行驗證，能夠正常生長的即為抗藥性突變體。

藥劑馴服誘導：在預培養(yǎng)菌落邊緣用打孔器制備直徑5 mm的菌餅，將菌餅接種于含嘧菌酯500 mg/L的AEA平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，直至扇形突變菌落出現(xiàn)。共處理200個菌餅，將獲得的突變體在含嘧菌酯500 mg/L的平板上進行再次生長驗證。

1.4 室內(nèi)敏感性測定

采用孢子萌發(fā)法[18]測定煙草赤星病菌敏感和抗性菌株對嘧菌酯的敏感性。分別將0.50 mL各濃度藥液與0.50 mL孢子懸浮液混合均勻，取100 μL該混合液滴于載玻片上，置于保濕培養(yǎng)皿中，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)12 h。嘧菌酯單獨作用時的最終供試濃度為0、0.5、1、10和40 mg/L；在100 mg/L水楊肟酸協(xié)同下，嘧菌酯最終供試濃度為0、0.5、1、10和40 mg/L。當空白對照孢子萌發(fā)率達到90%以上時，檢查各處理孢子萌發(fā)情況。以孢子芽管長度大于孢子的短半徑時視為萌發(fā)。每處理重復3次，隨機觀察3個視野，調(diào)查孢子總數(shù)不少于200個，記錄孢子萌發(fā)數(shù)及孢子總數(shù)，計算孢子萌發(fā)抑制率。

1.5 適合度的測定

以敏感菌株為對照，測定抗性突變體的菌絲生長、離體平板上的分生孢子產(chǎn)量、分子孢子的萌發(fā)及煙草葉片上的致病力。

1.5.1 菌絲生長 將從預培養(yǎng)菌落邊緣制取的5 mm菌餅置于無藥AEA平板中央，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，6天后“十字交叉法”量取菌落直徑。每個菌株3次重復。

1.5.2 分生孢子產(chǎn)量與萌發(fā) 參照Caten等[19]孢子產(chǎn)量的測定方法，測定各抗性突變體平板上分生孢子的產(chǎn)量。在同一平板內(nèi)，用5 mm直徑打孔器分別在距菌落邊緣2 mm的地方和距接菌餅2 mm的地方制取菌餅；從兩處各隨機挑取3個菌餅，共6個于2 mL離心管中。向離心管中加入1 mL無菌水，在渦旋儀上渦旋20秒洗下分生孢子，置于顯微鏡下檢查孢子的數(shù)量，計算單位面積上孢子的產(chǎn)量。各菌株3次重復。分子孢子的萌發(fā)在上述1.4敏感性測定的過程中進行檢測。

1.5.3 致病力 在煙草葉片上測定各抗藥性突變體的致病力。每菌株選取3片無病成熟煙草葉片，用無菌水沖洗干凈，吸干葉片上的水分。每葉片同一部位刺上相同的傷口，在傷口處接種直徑5 mm的菌餅（菌絲面朝上）。然后置于28 ℃、空氣相對濕度RH＞80%、每天12 h光照/12 h黑暗的條件下培養(yǎng)，9 d后觀察各抗藥性突變體的致病情況。

1.6 抗藥性突變體cyt b基因的測序與分析

將敏感菌株和突變體于PDA平板上活化，挑取少量菌絲于裝有50 μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR[寶生物工程（大連有限公司），TaKaRa貨號D304]的無菌PCR中，80 ℃水浴15 min后，低速離心，取上清液作為PCR反應的模板。采用特異性引物對敏感菌株和突變體的部分細胞色素b基因（cyt b）進行PCR擴增。利用特異性引物cytb-3 (5′-CAGAGCACCTAGAACTCT AGTATGAA-3′)和cytb-4(5′-AACAACTCAAGT AAACTCCTCC-3′)對細胞色素b基因129位和143位附近的序列進行PCR擴增[12]。擴增條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，共40個循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，參照質(zhì)粒pMD19-T（TaKaRa：D102A）的方法將其連接至載體上，將驗證后的轉(zhuǎn)化子送生工生物工程上海（股份）有限公司測序，分析突變體cyt b的堿基變化情況。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010軟件進行處理，以藥劑的濃度對數(shù)為橫坐標，以對病菌分生孢子萌發(fā)抑制率的對數(shù)值為縱坐標，建立線形回歸方程，并進行相關(guān)性分析。根據(jù)方程計算嘧菌酯抑制孢子萌發(fā)的EC50值。通過DPS（7.05）軟件進行統(tǒng)計分析。根據(jù)下列公式計算抗藥性突變體的抗性倍數(shù)：RF=EC50X/EC50WT，其中EC50X為被測菌株X的EC50值，EC50WT為敏感菌株的EC50值。

2 結(jié) 果

2.1 煙草赤星病菌嘧菌酯抗性突變體的誘導

室內(nèi)平板上藥劑馴服未獲得煙草赤星病菌嘧菌酯抗藥性突變體；而含藥平板上的紫外誘導獲得了煙草赤星病菌嘧菌酯抗藥性突變體4株，分別命名為CX-y1、CX-y2、CX-y3、CX-y4，誘導率為0.004%。表明該病菌具有在田間產(chǎn)生嘧菌酯抗藥性的遺傳和生化基礎(chǔ)，但在室內(nèi)通過紫外誘變來獲得煙草赤星病菌嘧菌酯抗性突變體的幾率很低。

2.2 室內(nèi)敏感性測定

由表1看出，在嘧菌酯0～40 mg/L測試范圍內(nèi)，隨著處理濃度的增加，所測菌株分生孢子萌發(fā)的抑制均逐漸增強。嘧菌酯1 mg/L單獨作用時，敏感菌株C2-1不能萌發(fā)；而突變體CX-y1、CX-y2、CX-y3和CX-y4在最高測試濃度40 mg/L時仍均有萌發(fā)，其萌發(fā)率分別為80%、72.80%、70.80%和68.31%。在100 mg/L水楊肟酸協(xié)同下，敏感菌株C2在0.5 mg/L嘧菌酯作用下不能萌發(fā)；而突變體CX-y1、CX-y2、CX-y3和CX-y4在最高測試濃度40 mg/L時的萌發(fā)率分別為9.70%、9.80%、7.60%和9.60%。

所有抗藥性突變體均降低了對嘧菌酯的敏感性。嘧菌酯單獨作用下，敏感菌株孢子萌發(fā)的EC50值為0.05 mg/L，突變體的EC50值均＞10 mg/L；在100 mg/L的水楊肟酸協(xié)同下，敏感菌株孢子萌發(fā)的EC50值為0.004 mg/L，突變體CX-y1、CX-y2、CX-y3及CX-y4的EC50值分別為0.17、1.13、2.06及0.43 mg/L，突變體的抗性倍數(shù)分別為42.50、282.50、515和107.50（表2）。

2.3 適合度

以敏感菌株為對照，測定了煙草赤星病菌嘧菌酯抗藥性菌株4個方面的適合度。結(jié)果表明，在適合度的4個方面，各突變體間存在著較大的差異。

在菌絲生長速率上，4株突變體的菌絲生長速度均較敏感菌株慢，其中最快的為CX-y2，其次為CX-y3和CX-y4，CX-y1最慢；在產(chǎn)孢量上，突變體CX-y1和CX-y2的產(chǎn)孢量較敏感菌株多，CX-y3與敏感菌株相當，CX-y4產(chǎn)孢量最少，低于敏感菌株；在分生孢子萌發(fā)率上，所有突變體的萌發(fā)率與敏感菌株相當；在致病力上，所有突變體均能順利侵染煙草葉片，并使其發(fā)?。ū?）。

表1 嘧菌酯及其協(xié)同SHAM對煙草赤星病菌敏感和抗藥性突變體孢子萌發(fā)的影響Table 1 Conidia germination sensitivity of Alternaria alternata to azoxystrobin among sensitive and resistant isolates with the synergism of salicylhydroxamic acid

表2 嘧菌酯及其協(xié)同SHAM對煙草赤星病菌敏感菌和抗藥性突變體的毒力Table 2 Toxicity of azoxystrobin with salicylhydroxamic acid to Alternaria alternata among the sensitive and resistant isolates

表3 煙草赤星病菌嘧菌酯抗性突變體的適合度Table 3 Fitness components of the resistant and sensitive isolates of Alternaria alternata to azoxystrobin

2.4 抗藥性突變體cyt b基因的測序與分析

cyt b基因129位和143位堿基發(fā)生的點突變是病原菌對嘧菌酯產(chǎn)生抗藥性的主要分子機理。以敏感菌株和突變體的DNA作為模版，利用特異性引物cytb-3/cytb-4對各菌株的cyt b基因進行PCR擴增，其擴增片段長度均在150 bp左右。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、鏈接pMD19-T載體及測序，成功獲得了敏感菌株和突變體的cyt b基因的部分序列。測序結(jié)果與GenBank中的已有序列DQ209283.1進行比對，結(jié)果表明4種突變菌株所測cyt b部分基因與敏感菌株的相同，基因的129位和143位堿基均未發(fā)生突變（圖1）。

圖1 煙草赤星病菌嘧菌酯敏感菌株和抗藥性突變體 cyt b基因部分序列比對結(jié)果Fig. 1 Sequence comparison of partial cyt b gene from both the azoxystrobin resistant mutants and the sensitive isolate of Alternaria alternate

3 討 論

煙草赤星病菌在一個生產(chǎn)季節(jié)可以造成多次再侵染，同時產(chǎn)生大量的分生孢子，這些孢子可以通過風、雨水等很容易地結(jié)合而進行遺傳物質(zhì)的交換與重組。因此，可以初步將它劃分為“中-高”等風險的病原菌。目前，殺菌劑抗性委員會還未對煙草赤星病菌進行抗藥性風險評價。本文誘導了煙草赤星病菌嘧菌酯抗藥性的突變體，研究了突變體的生物學性狀，并對突變體突變潛在的分子機理進行了探索。研究結(jié)果對評價煙草赤星病菌對嘧菌酯的抗藥性風險具有重要的意義。

對病原菌進行殺菌劑抗藥性風險評估的方法有很多，如：室內(nèi)對病原菌孢子的紫外線誘變、對孢子的N-亞硝基甲脲誘變、以及在田間高劑量的藥劑馴服等。然而，不同方法獲得的抗藥性突變體會表現(xiàn)出不同的適合度。病原菌抗藥性菌株適合度的強弱對指導病害的防治具有重要的指導意義。同煙草赤星病菌敏感菌株相比，嘧菌酯抗性突變體或菌絲生長速率減小而產(chǎn)孢量變大，或菌絲生長速率和產(chǎn)孢量均減小。因此本文室內(nèi)誘得的煙草赤星病菌嘧菌酯抗性菌株的田間適合能力可能比較弱；其在田間環(huán)境條件下的適應能力及其與敏感菌株在田間的競爭能力還有待于進一步研究。據(jù)報道，甲氧基丙烯酸酯類藥劑抗性是由細胞色素b的基因發(fā)生點突變引起的，包括氨基酸143位的丙氨酸突變?yōu)楦拾彼幔碐143A）[12]，氨基酸129位的亮氨酸突變?yōu)楸奖彼幔‵129L）[20]，及氨基酸137位的精氨酸突變?yōu)楦拾彼幔℅137R）[21]。G143A突變的抗性倍數(shù)一般在100倍以上，F(xiàn)129L和G137R突變的抗性倍數(shù)一般在5～15倍之間，少數(shù)會大于50倍[22]。本文通過紫外誘變獲得了4株煙草赤星病菌嘧菌酯抗性突變體，突變幾率低，抗藥性倍數(shù)＞100的3株、＜100的1株，突變體的適合度均低于敏感菌株。低頻率突變體的獲得可能與誘變所采用的方法和材料有關(guān)，同時紫外誘變具有很大的隨機性，以致可能出現(xiàn)cyt b基因靶位點以外的突變體。本文檢測突變體的cyt b基因潛在位點均未有發(fā)生突變，說明煙草赤星病菌對嘧菌酯可能存在其他的潛在突變基因或者突變位點，有必要進一步深入研究以探尋其產(chǎn)生抗藥性的分子機理。

煙草赤星病通常在煙草采烤期發(fā)生，危害時間約2個月。雖然條件適宜時病原菌能夠迅速流行與傳播；但同蔬菜灰霉病、白粉病等相比，赤星病菌的再侵染次數(shù)較少，病原菌群體在藥劑壓力下的接觸時間相對較少。因而，可把煙草赤星病菌初步視為低等風險病原菌。本文通過藥劑馴服和紫外誘變均沒有獲得嘧菌酯靶基因的突變體。結(jié)合煙草赤星病菌的生物學特性，該病原菌對嘧菌酯的抗藥性風險應該屬于低等水平。

參考文獻

[1] Wang H C, Huang Y F, Tang X G, et al. Leaf and stem rot of tobacco (Nicotiana tabacum) caused by Rhizopus oryzae in closed curing barns in Guizhou province of China [J]. Plant Disease, 2016, 100(2): 536.

[2] Wang H C, Wang M S, Xia H Q, et al. First report of Fusarium wilt of tobacco caused by Fusarium kyushuense in China [J]. Plant Disease, 2013, 97(3): 424.

[3] 劉學敏，李大壯，常穩(wěn). 煙草赤星病研究現(xiàn)狀及存在問題[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報，2000，31（1）：80-85.

[4] Stavely J R, Main C E. Influence of temperature and other factors on initiation of tobacco brown spot [J]. Phytopathology, 1970, 60: 1591-1596.

[5] Lucas G B. Alternaria alternata (Fries) Keissler, the correct name for A. tenuis and A. longipes[J]. Tobacco Science, 1971 (15): 37-42.

[6] Stavely J R. Relationship of post inoculation leaf wetness to initiation of tobacco brown spot [J]. Phytopathology, 1975, 65: 897-901.

[7] 彭希文，劉光珍，楊永柱，等. 云南省煙草赤星病（Tobacco brown spot）病原研究及其防治藥劑的篩選[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學學報，2000，22（2）：153-156.

[8] 孟建玉，曹毅，陸寧，等. 貴州省煙草赤星病菌對菌核凈的抗藥性[J]. 植物保護學報，2013，40（5）：497-480.

[9] Pasche J S, Wharam C M, Gudmestad N C. Shift in sensitivity of Alternaria solani (potato early blight) to strobilurin fungicides [J]. Proceedings of the BCPC Conference Pests & Disease, 2002, 33(8), 841-846.

[10] Arreaza J M, Hernández L. Evaluation of azoxystrobin on the early blight control (Alternaria solani) in tomatoes [J]. Revista De La Facultad De Agronomia De La Universidad Del Zulia, 2001, 18(2): 106-116.

[11] Ma Z, Felts D, Michailides T J. Resistance to azoxystrobin in Alternaria isolates from pistachio in California [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2003, 77(2): 66-74.

[12] Ma Z, Michailides T J. An allel-specific PCR assay for detecting azoxystrobin-resistant Alternaria isolates from pistachio in California[J]. Journal of Phytopathology, 2004, 152(2): 118-121.

[13] Brandt U, Schagger H, von Jagow G. Characterization of binding of the methoxyacrylate inhibitors mitochondrial cytochrome c reductase[J]. European Journal of Biochemistry, 1988, 173(3): 499-506.

[14] Hellwig V, Dasenbrock J, Klostermeyer D. New benzodioxepin type strobilurins from basidiomycetes structural revision and determination of the absolute configuration of strobilurin D and related methoxyacrylate antibiotics[J]. Tetrahedron, 1999, 55(33): 10101-10118.

[15] Becker W F, Jagow G V, Anke T. Oudemansi, strobilurin A, strobilurin B and myxothiazol: new inhibitors of the Bcl segment of the respiratory chain with an E-βmethoxyacrylate system as common structural element[J]. FEBS Lett, 1981, 132(2): 329-333.

[16] Brent K J, Hollomon D W. Fungicide resistance: the assessment of risk[M]. FRAC Monograph No. 2, Global Crop Protection Federation, Brussels, 1998: 48.

[17] Lu Y L, Sutton T B, Ypema, H. Sensitivity of Alternaria mali from North Carolina apple orchards to pyraclostrobin and boscalid [J]. Phytopathology, 2003, 93: S54.

[18] 黃艷飛，陳慶園，王進，等. 線粒體旁路氧化途徑抑制劑水楊肟酸（SHAM）協(xié)同下煙草赤星病菌對嘧菌酯的敏感性[J]. 中國煙草學報，2015，21（6）：65-70.

[19] Caten C E, Jinks J L. Spontaneous variability of single isolates of Phytophthora infestans. I. Cultural variations[J]. Can J Bot, 1968, 46: 329-348.

[20] Pasche J S, Piche L M, Gudmestad N C. Effect of the F129L mutation in Alternaria solani on fungicides affecting mitochondrial respiration[J]. Plant Disease, 89(3): 269-278.

[21] Sierotzki H, Frey R, Wullschleger J, et al. Cytochrome b gene sequence an structure of Pyrenophora teres and P. tritici-repentis and implications for QoI resistance [J]. Pest Mangement Science, 2007, 63(3): 225-233.

[22] Leadbeater A, Sierotzki H, Varney P. Mutations associated with QoI-resistance [R]. FRAC QoI Working Group, 2006.

Induction and Characterization of Laboratory Mutants of Alternaria alternata Resistant to Azoxystrobin

WANG Hancheng1, XUE Juanjuan2, HUANG Yanfei2, WANG Maosheng1, ZHANG Changqing2

（1. Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550081, China; 2. College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou, Hubei 434025, China）

This study was conducted to analyze the risk of resistance of Alternaria alternata to azoxystrobin. Resistant mutants were induced by incubating mycelial plugs and mutating conidia on poisoned agar plates. Mutant characterization and mechanism of resistance were also studied and the target gene cyt b was analyzed using partial sequence analysis. Four mutants of A. alternata with resistance to azoxystrobin were isolated. No mutant was obtained through mycelial plug incubation while four mutants were isolated through conidia mutation, with a frequency of around 0.004%. The resistance factors for the four mutants were 42.50, 282.50, 515 and 107.50, respectively. All resistant strains displayed a highly reduced sensitivity to azoxystrobin. Studies of fitness parameters in the wild-type and mutant strains of A. alternata showed that all resistant isolates had equal abilities on conidia germination and virulence, and less ability in mycelial growth. Three mutants showed enhanced ability of conidia production, while the other one decreased its’ conidia production. Sequence analysis of the target gene cyt b showed that there was no point mutation at position 129 or 143 on neither the four mutants or the sensitive isolate of A. alternata. This is believed to be the first report of different levels of azoxystrobin resistance in A. alternata. These studies suggested that the risk of resistance development in A. alternata was low for azoxystrobin.

azoxystrobin; fungicide resistance; Alternaria alternata; strobilurin fungicide; mutant

S435.72

1007-5119（2016）06-0066-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.06.012

國家自然科學基金項目“基于表型組學的嘧菌酯對煙草赤星病菌的作用機理及其抗性機理研究”（31360448）

汪漢成，男，博士，研究員，主要從事植物保護及煙草微生物研究。E-mail：xiaobaiyang126@hotmail.com

2016-05-10

2016-09-13