曹繼芬，戶(hù)艷霞，王新中，徐發(fā)華，楊明英，趙志堅(jiān)*

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明 650205；2.云南省煙草公司大理州公司，云南 大理 671000）

基于微管蛋白基因的煙草根黑腐病菌分子檢測(cè)

曹繼芬1，戶(hù)艷霞2，王新中2，徐發(fā)華2，楊明英1，趙志堅(jiān)1*

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明 650205；2.云南省煙草公司大理州公司，云南 大理 671000）

建立一種煙草根黑腐病菌新靶標(biāo)的分子檢測(cè)方法。以β-微管蛋白基因?yàn)榘袠?biāo)設(shè)計(jì)了特異性引物Tbas-tub2F/Tbas-tubR用于根黑腐病菌的PCR檢測(cè)，對(duì)其檢測(cè)特異性、靈敏度、早期診斷技術(shù)進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果顯示，只有根黑腐病菌能擴(kuò)增到一條254 bp的特異性條帶，其他19種真菌、卵菌及陰性對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，表明該對(duì)引物能特異性地檢測(cè)根黑腐病菌。該引物對(duì)根黑腐病菌基因組DNA檢測(cè)的靈敏度為10 fg/μL。Tbas-tub2F/Tbas-tubR可從接種侵染24 h后的煙草組織中檢測(cè)到根黑腐病菌，從而對(duì)根黑腐病進(jìn)行準(zhǔn)確的早期診斷。開(kāi)發(fā)了煙草根黑腐病菌新靶標(biāo)的分子檢測(cè)和早期診斷技術(shù)。

煙草；根黑腐病菌；β-微管蛋白基因；分子檢測(cè)

煙草根黑腐病是由根串珠霉[Thielaviopsis basicola (Berk. et Br.)]在煙草上引起的一種重要真菌性土傳病害[1]，它遍布世界主要產(chǎn)煙區(qū)，使煙草生產(chǎn)遭受重大損失。該病原菌可侵染為害多種植物，如煙草、棉花、豆類(lèi)、花生、柑桔及多種觀賞的植物[2-7]。煙草根黑腐病近年來(lái)在我國(guó)有加重為害的趨勢(shì)，云南、貴州、湖北等省發(fā)生較重，山東、河南、安徽、吉林、福建等省也有發(fā)生[8]。煙草根黑腐病與煙草疫霉引起的黑脛病早期侵染癥狀相似，而且常與其他煙草根莖部病害混合發(fā)生，給病害的識(shí)別與診斷造成困難，影響病害的正確防控。傳統(tǒng)的植物病害檢測(cè)方法因檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜、靈敏度低，且經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)，難以快速、準(zhǔn)確地鑒定，很容易錯(cuò)過(guò)病害防治的最佳時(shí)期。建立快速、簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，可對(duì)病害的早期診斷和及時(shí)防控提供科學(xué)依據(jù)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)為代表的分子檢測(cè)方法得到了迅速的發(fā)展和應(yīng)用，其具有的特異性、靈敏性和快速性等特點(diǎn)成為植物病原菌分類(lèi)和鑒定應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，有效地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類(lèi)鑒定方法的不足[9-13]。尤其是基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time-PCR）和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）可視化快速檢測(cè)新技術(shù)已在一些植物病原菌的檢測(cè)中得到成功應(yīng)用，是今后植物病害快速檢測(cè)的新方向[14-15]。最近，基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)煙草根黑腐病菌的技術(shù)已成功建立，檢測(cè)的靈敏度比傳統(tǒng)的PCR提高了10～100倍[14]。目前已報(bào)道的煙草根黑腐病菌分子檢測(cè)技術(shù)均是針對(duì)病原菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）設(shè)計(jì)的特異擴(kuò)增引物[8,14]，檢測(cè)的靶標(biāo)非常單一，通常難以區(qū)分親緣關(guān)系較近的近緣種，因此有必要開(kāi)發(fā)新的靶標(biāo)作為已有檢測(cè)方法的補(bǔ)充。β-微管蛋白基因包含有多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，內(nèi)含子在不同物種之間有較大的變異，適合于設(shè)計(jì)引物進(jìn)行分子檢測(cè)以區(qū)分不同的物種[16]。煙草根黑腐病菌的β-微管蛋白基因能否作為新的分子檢測(cè)靶標(biāo)，本研究對(duì)該靶標(biāo)進(jìn)行了特異性PCR檢測(cè)引物篩選，并對(duì)其檢測(cè)特異性、靈敏度、早期診斷技術(shù)進(jìn)行了分析，以期為煙草根黑腐病的快速檢測(cè)和早期診斷提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

不同種類(lèi)的真菌和卵菌供試菌株共23個(gè)（表1）。其中根串珠霉參考菌株YYD和YYZ由西南大學(xué)竇彥霞博士惠贈(zèng)[17]，其余菌株均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所作物疫病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 病原菌基因組及植物組織DNA的制備

供試菌株分別在V8液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周后，用滅菌濾紙壓干水分收獲菌絲體。供試菌株菌絲體DNA與健康煙草脛部和根部組織DNA均采用改良的CTAB法進(jìn)行提取。獲得的基因組DNA加入含有10 μg/mL RNase A的滅菌超純水進(jìn)行溶解，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 特異性擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)及PCR檢測(cè)

從GenBank下載根黑腐病菌和其他物種的β- 微管蛋白基因DNA序列，基于目前已報(bào)道的根黑腐病菌β-微管蛋白基因，與其他物種進(jìn)行多序列比對(duì)、分析?；诟诟【c其他物種堿基差異較大的區(qū)域，利用Primers3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)用于煙草根黑腐病菌特異性分子檢測(cè)的引物，即Tbas-tub1F/Tbas-tubR（序列為：上游引物Tbas-tub1F：5′-ACGTACCGCCCTATCAATCC -3′，下游引物Tbas-tubR：5′-ATGCGCTTGAACAG CTCCTG -3′），預(yù)期擴(kuò)增片段大小為260 bp，Tbastub2F/Tbas-tubR（序列為：上游引物Tbas-tub2F：5′-CGCCCTATCAATCCACTTATCC -3′，下游引物Tbas-tubR：5′-ATGCGCTTGAACAGCTCCTG-3′），預(yù)期擴(kuò)增片段大小為254 bp。引物由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（TaKaRa）儀器上完成。50 μL PCR反應(yīng)體系包括5 μL 10× reaction Buffer，5 μL 100 mmol/L MgCl2buffer，4 μL 2.5 mmol/L dNTP Mixture，10 μmol/L引物各1 μL，0.5 μL rTaq Polymerase (2.5 U/μL)，加入1μL模板DNA后用滅菌超純水補(bǔ)足體積。熱循環(huán)反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性40 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在Bio-Rad ChemiDoc MP（Bio-Rad）凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

1.4 引物Tbas-tub2F /Tbas-tubR對(duì)煙草根黑腐病菌的靈敏性檢測(cè)

提取的煙草根黑腐病菌基因組DNA經(jīng)Thermo Nanodrop 2000分光光度計(jì)（Thermo）測(cè)定濃度后，采用10倍系列稀釋基因組DNA濃度為100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg備用。利用Tbas-tub2F/Tbas-tubR引物對(duì)煙草根黑腐病菌10倍系列稀釋基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20 μL PCR反應(yīng)體系包括2 μL 10× reaction Buffer，1.2μL Mixture，10 μmol/L引物各0.4 μL，0.1 μL rTaq100 mmol/L MgCl2buffer，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTPPolymerase (5 U/μL)，加入1 μL模板DNA后 用滅菌超純水補(bǔ)足體積。熱循環(huán)反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性40 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR結(jié)束后進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 煙草根黑腐病菌特異性分子檢測(cè)供試菌株Table 1 The plant pathogens used in specific molecular detection

1.5 煙草根黑腐病菌的早期快速診斷

1.5.1 煙草根黑腐病病樣組織的準(zhǔn)備 用手術(shù)刀切取PDA培養(yǎng)1周的煙草根黑腐病菌菌絲塊1 cm×1 cm接種在生長(zhǎng)6周的健康煙草品種紅花大金元根莖結(jié)合處，22～23 ℃RXZ智能型人工氣候箱（寧波江南儀器廠）中保濕培養(yǎng)。分別取接種后6、12、24、48、72 h和5 d的煙草根莖部作為病樣組織用于DNA的提取，3次重復(fù)。

1.5.2 煙草帶病組織DNA快速提取及PCR檢測(cè) 煙草根黑腐病菌侵染的病組織按照NaOH快速裂解法提取DNA[18]。具體過(guò)程如下：將未接種的健康煙苗根莖部和侵染6、12、24、48、72 h和5 d的煙草帶病組織（病莖、病根）用自來(lái)水清洗干凈、吸水紙吸干水分，用手術(shù)刀切取含接種點(diǎn)上下各1.5 cm組織并稱(chēng)量；按1 mg病組織加入10 μL裂解液（0.5 mol/L NaOH + 0.5% PVP）計(jì)量，根據(jù)病組織的質(zhì)量，加入適量的裂解液，在滅菌研缽中充分將病組織研磨后轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，12 000 rpm離心5 min；取100 μL上清液與等體積的0.1 mol/L Tris（pH 8.0），混勻；取1 μL混合液作為模板直接用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。使用與1.4相同的PCR反應(yīng)體系和熱循環(huán)反應(yīng)參數(shù)，每個(gè)病樣組織DNA樣品3次重復(fù)。PCR結(jié)束后進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

2 結(jié) 果

2.1 煙草根黑腐病菌特異性引物的設(shè)計(jì)及PCR檢測(cè)

基于煙草根黑腐病菌β-微管蛋白基因設(shè)計(jì)的特異性分子檢測(cè)的引物Tbas-tub1F/Tbas-tubR從YYZ和YYD兩個(gè)煙草根黑腐病菌參考菌株中均能擴(kuò)增出唯一的、符合預(yù)期大小的目的片段，但是從其他供試的3個(gè)非煙草根黑腐病菌的對(duì)照菌株中也擴(kuò)增出大小不一的片段（圖1），表明該引物對(duì)可以用于已知根黑腐病菌的檢測(cè)，但是特異性不高，不適于煙草根黑腐病的診斷。另一引物對(duì)Tbas-tub2F/TbastubR的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示（圖2），所有供試的DNA樣品中只有4個(gè)煙草根黑腐病菌能擴(kuò)增出唯一的、符合預(yù)期大小的目的片段，而其他用作對(duì)照的不同疫霉、腐霉和真菌及陰性對(duì)照均沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，表明設(shè)計(jì)的引物對(duì)Tbas-tub2F/Tbas-tubR能夠特異性地檢測(cè)煙草根黑腐病菌，可以用于煙草根黑腐病的診斷分析。

圖1 Tbas-tub1F/Tbas-tubR對(duì)煙草根黑腐病菌的 PCR特異性擴(kuò)增Fig. 1 Specific-PCR amplification of primers Tbastub1F/Tbas-tubR to Thielaviopsis basicola

圖2 Tbas-tub2F /Tbas-tubR對(duì)煙草根黑腐病菌的 PCR特異性擴(kuò)增Fig. 2 Specific-PCR amplification of primers Tbastub2F/Tbas-tubR to Thielaviopsis basicola

2.2 引物Tbas-tub2F/Tbas-tubR對(duì)煙草根黑腐病菌的靈敏性檢測(cè)

以10倍系列稀釋的煙草根黑腐病菌基因組DNA為模板，特異性引物對(duì)Tbas-tub2F/Tbas-tubR從100 ng至10 fg均可擴(kuò)增出一條大小為254 bp的特異性條帶，其中100 fg和10 fg擴(kuò)增的條帶相對(duì)較弱，當(dāng)模板DNA濃度低至1 fg時(shí)，未能擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶，表明Tbas-tub2F/Tbas-tubR引物對(duì)煙草根黑腐病菌的檢測(cè)靈敏度下限可達(dá)10 fg，如圖3。該結(jié)果比已報(bào)道的以ITS為靶標(biāo)設(shè)計(jì)煙草黑脛病菌特異性檢測(cè)的引物靈敏度檢測(cè)極限100 fg高10倍，更高于劉萍花等[19]報(bào)道的10 pg/μL，表明以β-微管蛋白基因?yàn)榘袠?biāo)設(shè)計(jì)的引物對(duì)煙草根黑腐病菌有較高的檢測(cè)靈敏度，優(yōu)于以ITS為靶標(biāo)設(shè)計(jì)的引物。

2.3 煙草根黑腐病菌的早期快速診斷

按照NaOH快速裂解法提取煙草組織DNA， 用作陰性對(duì)照的健康煙草組織、煙草根黑腐病菌侵染6、12 h的病樣組織均沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物；而從煙草根黑腐病菌侵染24、48、72 h和5 d的病樣組織與用作陽(yáng)性對(duì)照的根黑腐病菌DNA可以擴(kuò)增出一條清晰的大小為254 bp的條帶（圖4），說(shuō)明煙草組織中檢測(cè)出了根黑腐病菌，發(fā)病組織感染了煙草根黑腐病菌。結(jié)果還進(jìn)一步表明，通過(guò)煙草帶病組織DNA快速提取方法，Tbas-tub2F/Tbas-tubR引物在根黑腐病菌侵染的初期階段即6 h和12 h時(shí)，不能從煙草組織中檢測(cè)到病原菌，可能是因?yàn)榍秩境跗陔A段侵入煙草組織內(nèi)部的菌量較少、用NaOH法快速提取的病原菌DNA濃度過(guò)低而檢測(cè)不到，但在根黑腐病菌侵染煙草24 h以后，即植株尚未顯病癥的早期階段，Tbas-tub2F/Tbas-tubR引物可從煙草組織中檢測(cè)到病原菌，從而對(duì)根黑腐病進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷和鑒定。

圖3 Tbas-tub2F/Tbas-tubR對(duì)煙草根黑腐病菌 的靈敏度檢測(cè)Fig. 3 Sensitivity detection of Tbas-tub2F/Tbas-tubR to genomic DNA of T. basicola

圖4 不同侵染階段煙草組織中根黑腐病菌的快速診斷Fig. 4 Rapid diagnosis of T. basicola in tobacco tissues at different infection stages

3 討 論

PCR技術(shù)的建立極大地提高了植物病原菌分類(lèi)鑒定和病害診斷的效率，成為植物病害研究中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，有效地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類(lèi)鑒定方法的不足[9-13]。根黑腐病是煙草生產(chǎn)中重要的土傳病害，常與其他煙草腐生性病害混合侵染，給病害的正確診斷造成困難。目前已有研究者報(bào)道了對(duì)煙草根黑腐病菌的分子檢測(cè)技術(shù)，如趙永強(qiáng)等[8]根據(jù)煙草病原真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列間的差異，設(shè)計(jì)了特異性引物TB-5/TB-3，對(duì)T.basicola進(jìn)行了分子檢測(cè)，其靈敏度可達(dá)100 fg/μL。康振輝等[14]根據(jù)ITS區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物Tb1/Tb2，建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)土壤中的煙草根黑腐病菌，結(jié)果表明，該體系的檢測(cè)下限為100 fg/μL基因組DNA。劉萍花等[19]也使用趙永強(qiáng)等[8]報(bào)道的特異性引物，建立了多重PCR檢測(cè)煙草黑脛病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌和立枯病菌的技術(shù)體系，該體系檢測(cè)的靈敏度下限為10 pg/μL，低于前人報(bào)道的100 fg/μL。以上的根黑腐病菌檢測(cè)技術(shù)均是基于靶標(biāo)ITS區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行的檢測(cè)，一旦有親緣關(guān)系較近的近緣種，僅靠單個(gè)靶標(biāo)ITS區(qū)間DNA序列的差異可能難以區(qū)分不同的近緣種，因此有必要開(kāi)發(fā)新的靶標(biāo)來(lái)互補(bǔ)已有的檢測(cè)方法。以上這些研究?jī)H針對(duì)根黑腐病菌進(jìn)行了特異性檢測(cè)，沒(méi)有對(duì)病害的早期診斷進(jìn)行測(cè)試，因此不能確定報(bào)道的特異性引物是否能用于病害的早期診斷。

生物的微管蛋白主要由α-微管蛋白和β-微管蛋白組成，對(duì)于保持細(xì)胞形狀、運(yùn)動(dòng)、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸有不可或缺的作用，是維持生物基本功能的持家基因。B-微管蛋白基因包含有多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，內(nèi)含子在不同物種之間有較大的變異，適合于作為靶標(biāo)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行分子檢測(cè)區(qū)分不同的物種。本研究基于煙草根黑腐病菌β-tubulin基因序列與其他物種進(jìn)行多重比對(duì)分析后，根據(jù)特異基因片段開(kāi)發(fā)了新的煙草根黑腐病菌PCR檢測(cè)引物Tbastub2F/Tbas-tubR，對(duì)其檢測(cè)特異性、靈敏度進(jìn)行了研究，結(jié)果表明該引物特異性強(qiáng)，只能從煙草根黑腐病菌的基因組DNA中擴(kuò)增出254 bp的片段，不能從其他供試的19種真菌和卵菌的基因組DNA中擴(kuò)增出任何片段。相對(duì)于已報(bào)道的ITS靶標(biāo)開(kāi)發(fā)的引物僅對(duì)少量不同病原菌進(jìn)行的測(cè)試，本研究可以充分保證檢測(cè)結(jié)果的特異性。通過(guò)對(duì)煙草根黑腐病菌DNA系列濃度梯度為模板的擴(kuò)增結(jié)果顯示，本研究開(kāi)發(fā)的引物對(duì)煙草根黑腐病菌的檢測(cè)靈敏度下限為10 fg/μL，能夠?qū)ξ⒘康臒煵莞诟【M(jìn)行檢測(cè)，該結(jié)果與ITS為靶標(biāo)設(shè)計(jì)的引物靈敏度有所差異，檢測(cè)極限優(yōu)于ITS為靶標(biāo)的100 fg/μL，而且也優(yōu)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)極限100 fg/μL[8,14]，說(shuō)明以β-tubulin基因?yàn)榘袠?biāo)開(kāi)發(fā)的引物檢測(cè)靈敏度更高，可以檢測(cè)出更微量的病原菌。對(duì)病原菌侵染煙草不同時(shí)段的組織進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，本研究以β-tubulin基因?yàn)榘袠?biāo)開(kāi)發(fā)的特異性引物在根黑腐病菌侵染的初期階段即6 h和12 h時(shí)，該引物不能從煙草組織中檢測(cè)到病原菌，可能與侵染初期階段侵入煙草組織內(nèi)部的菌量較少、采用NaOH快速裂解法提取煙草帶病組織DNA的濃度過(guò)低有關(guān)。但在根黑腐病菌侵染煙草24 h、肉眼尚不能觀察到病癥的早期階段，即可從煙草組織中檢測(cè)到病原菌，從而對(duì)根黑腐病進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷和鑒定，表明Tbastub2F/Tbas-tubR引物可用于煙草根黑腐病的早期診斷，我們將在進(jìn)一步的研究中用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)早期侵染進(jìn)行診斷。此外，從煙草黑腐病病樣組織清洗、病原菌或病樣組織DNA快速提取、PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳到獲得檢測(cè)結(jié)果，整個(gè)過(guò)程可在3.5 h以?xún)?nèi)完成，與常規(guī)的生物檢測(cè)方法相比，操作簡(jiǎn)單便捷，大大縮短了鑒定所需的時(shí)間，可及時(shí)對(duì)生產(chǎn)提供防控參考。

4 結(jié) 論

本研究開(kāi)發(fā)了煙草根黑腐病菌新的分子檢測(cè)靶標(biāo)，設(shè)計(jì)的特異性PCR擴(kuò)增引物Tbas-tub2F/TbastubR有較高的檢測(cè)靈敏度，可用于煙草根黑腐病菌的快速鑒定及病害的早期診斷。

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《煙草科技》2016年第12期目次

硅對(duì)鎘脅迫下煙草光合作用的影響……………………….………………………………………鄭明瑜，羅麗娟，李薈星，等 1

授粉時(shí)期和套袋方式對(duì)煙草母本起源單倍體鑒定效率的影響…………………………………曾建敏，焦芳嬋，童治軍，等 8

洛陽(yáng)地區(qū)煙草根際土壤中多粘類(lèi)芽孢桿菌的分離與鑒定………………………………………宋喜樂(lè)，趙世民，趙云波，等 13

烤煙中部煙葉外觀區(qū)域特征分布及其與外觀品質(zhì)和物理特性的關(guān)系…………………………過(guò)偉民，蔡憲杰，王信民，等 21

煙梗（末）有機(jī)肥對(duì)煙田土壤養(yǎng)分、病害發(fā)生及煙葉產(chǎn)質(zhì)量的影響……………………………耿明明，趙 建，賈瑞蓮，等 28

煙草生物堿：口腔特性及在電子煙煙氣中的感官響應(yīng)………………….………………………劉俊輝，楊偉平，張啟東，等 35

國(guó)內(nèi)口用型無(wú)煙氣煙草制品專(zhuān)利分析……………………….……………………………………劉亞麗，鄭新章，洪群業(yè)，等 40

卷煙紙裂解致孔對(duì)主流煙氣中HCN釋放量的影響……………………….……………… ……劉 源，銀董紅，尹升福，等 46

HPLC-MS/MS法測(cè)定煙用紙張中的高氯酸根……………………….……………………………王 穎，楊 飛，邊照陽(yáng)，等 54

微波膨脹梗絲加工工藝的選擇及優(yōu)化……………………….……………………………………趙云川，鄒 泉，廖曉祥，等 60

基于分布活化能模型的煙草燃燒動(dòng)力學(xué)特性研究……………………….………………………王 昭，戴 亞，馬擴(kuò)彥，等 71

基于線(xiàn)光源傳感器的濾棒長(zhǎng)度在線(xiàn)測(cè)量系統(tǒng)……………………….…………………………………王 盛，陸海華，鄭林杰 79

梗絲超級(jí)回潮機(jī)含水率控制系統(tǒng)的改進(jìn)……………………….…………………………………… ……………………丘柳明 86

基于熱力圖的卷煙市場(chǎng)數(shù)據(jù)可視分析系統(tǒng)……………………….………………………… ………鄧 超，宋金偉，孫瑞志等 91

Molecular Detection of Tobacco Black Root Rot Pathogen Based on β-tubulin Gene

CAO Jifen1, HU Yanxia2, WANG Xinzhong2, XU Fahua2, YANG Mingying1, ZHAO Zhijian1*

(1. Agricultural Environment & Resources Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650205, China; 2. Dali Branch of Yunnan Tobacco Company, Dali, Yunnan 671000, China)

To establish a molecular detection method of new target for tobacco black root rot caused by Thielaviopsis basicola, βtubulin gene was selected as a new target and a pair of species-specific primers Tbas-tub2F /Tbas-tubR was designed to detect T. basicola by PCR. The specificity, sensitivity and early diagnosis technology of the primers were assayed. The results showed that an expected 254 bp band could be amplified only from T. basicola and no PCR product was amplified from any of the other nineteen fungi and oomycetes and negative control, which suggested that the primers could be used to detect T. basicola specifically. The detection sensitivity of Tbas-tub2F/Tbas-tubR primers was 10 fg genomic DNA of T. basicola. The pathogen could be detected from tobacco tissues 24 hours post inoculation thus the primers were good for early accurate diagnosis of tobacco black root rot disease. In this study we developed an alternative new target for both molecular detection and early diagnosis of tobacco black root rot caused by T. basicola.

tobacco; Thielaviopsis basicola; β-tubulin gene; molecular detection

S435.72

1007-5119（2016）06-0060-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.06.011

中國(guó)煙草總公司云南省公司科技項(xiàng)目“大理州紅花大金元兩黑病持續(xù)控制技術(shù)研究及應(yīng)用”（2013YN27）

曹繼芬（1971-），女，副研究員，主要從事植物真菌、卵菌病害研究。E-mail：cjf016@sina.com。*通信作者，E-mail：zhijianzhao@hotmail.com

2016-03-10

2016-10-10