許冠堂，趙洪海

（青島農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與植物保護學院，山東省植物病蟲害防控重點實驗室，青島 266109）

三種土壤濕度狀況下煙草孢囊線蟲侵染特征比較

許冠堂，趙洪海*

（青島農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與植物保護學院，山東省植物病蟲害防控重點實驗室，青島 266109）

為明確土壤濕度對煙草孢囊線蟲（Heterodera glycines，HGT）侵染的影響，采用定量接種和杯栽試驗方法，通過定期取樣、土壤中線蟲分離和根組織中線蟲染色后鏡檢，測定了3種土壤濕度—低濕度（體積含水量MVP 3%～9%）、中濕度（MVP 15%～25%）和高濕度（MVP 30%～40%）狀況下HGT不同蟲態(tài)群體密度及其動態(tài)變化。結(jié)果表明，與中濕度處理相比，低濕度處理下，HGT 2齡幼蟲在土壤中的孵化和對根系的侵入均受到抑制，根組織中3齡和4齡幼蟲發(fā)育量明顯減少且發(fā)育進程延遲；高濕度處理下，HGT 2齡幼蟲對煙草根系的侵入加快，根組織中3齡和4齡幼蟲的發(fā)育提前。低、中和高濕度處理下HGT的繁殖系數(shù)（Rf）分別為0.7、1.0和0.4?？梢?，土壤濕度過低和過高均不利于HGT正常侵染，濕度過高對HGT繁殖的抑制作用尤其明顯。

煙草孢囊線蟲；濕度處理；發(fā)育進程；繁殖系數(shù)

植物寄生線蟲是多種作物上的有害生物，對世界農(nóng)業(yè)造成相當大經(jīng)濟損失[1]。煙草孢囊線蟲病是煙草重要病害，在國外由煙草球孢囊線蟲3個亞種（Globodera tabacum subsp. tobacum、G. tobacum subsp. virginiae和G. tobacum subsp. solanacearum）引起，在我國由大豆孢囊線蟲（Heterodera glycines）引起，其嚴重侵染可導致煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的明顯降低[2-4]。目前煙草孢囊線蟲病只發(fā)生在我國的山東和河南兩省，在山東省發(fā)生普遍[5]。煙草孢囊線蟲病對煙草的損害程度除取決于煙草品種抗性和線蟲群體密度外，還受溫濕度等環(huán)境因素的影響[2,6-7]。線蟲在土壤中的活動離不開水，其存活、孵化和侵入均受土壤水分的影響[8]。本項目組研究表明，在煙草生長期階段性長期（1～2個月）過度澆水明顯抑制煙草孢囊線蟲（H. glycines）的侵染[9]，但土壤水分不足對煙草孢囊線蟲的侵染有何影響尚未測定。故而設(shè)計本試驗，擬在探討低、中、高3種土壤濕度下煙草孢囊線蟲的侵染特征，為其綜合治理水分管理這一農(nóng)業(yè)防控措施的實施提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

用于接種的線蟲群體為侵染煙草的大豆孢囊線蟲（Heterodera glycines），在此縮寫為HGT，采自山東省諸城市辛興鎮(zhèn)煙葉農(nóng)場。煙草品種為中煙100，由中國農(nóng)科院煙草研究所提供。煙草定植器采用容積為210 mL的聚丙烯水杯，杯高8.5 cm。

1.2 線蟲接種

2015年5月7日，60個水杯裝砂壤土，裝土量150 g/杯，然后每杯移栽1株3～4片真葉煙苗，充分澆水后置溫室內(nèi)在22～32 ℃下緩苗。5 d后當水杯土壤體積含水量降至5%時接種HGT：在煙株周圍土壤上用玻璃棒打3個孔，孔深至煙草根系水平，孔內(nèi)分別置入3、3和4個大小一致的飽滿孢囊（接種前先將孢囊刺破，以便于日后調(diào)查時新生孢囊的甄別），壓土封孔。每杯共接種孢囊10個，即HGT初始孢囊群體密度（Pi）為6.7個/100g土壤。

1.3 土壤濕度處理和煙株培養(yǎng)

2015年5月12日接種孢囊后，立即對杯土進行3種土壤濕度處理，處理數(shù)量為每處理20 杯。低濕度處理：不澆水，保持5%的體積含水量；中濕度處理：澆水15 mL/杯，使土壤體積含水量達20%；高濕度處理：澆水25 mL/杯，使土壤體積含水量達35%。處理后將杯苗立即放置在光照培養(yǎng)箱中，在12 h光照/12 h黑暗、25 ℃和80% RH下培養(yǎng)35 d。在培養(yǎng)過程中，使用土壤濕度測量儀每隔48 h檢測1次杯土濕度并及時補充水分，將低、中和高濕度處理的杯土體積含水量分別控制在3%～9%、15%～25%和30%～40%范圍內(nèi)。

1.4 調(diào)查和檢測方法

取樣：接種線蟲后第10、20、30和35天各取1次樣，每個處理每次取5杯。將煙草根系上的白色雌蟲（如果有）全部抖落到各自杯土中，然后分離各杯土壤中的線蟲，并對各杯根組織中的線蟲染色。

土樣中線蟲的分離和計數(shù)：采用淘洗-過篩法和淘洗-過篩-貝曼漏斗法分離每個水杯土壤中的白色雌蟲、孢囊和2齡幼蟲（J2）[10]，在解剖鏡下對白色雌蟲、新生孢囊和J2進行檢查并計數(shù)。

根組織中線蟲的染色和計數(shù)：采用次氯酸鈉-酸性品紅染色法對每個水杯煙草根組織內(nèi)的線蟲進行定量染色[10]，在解剖鏡和顯微鏡下對J2、3齡幼蟲（J3）和4齡幼蟲（J4）進行檢查并計數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

計算每100 g土壤中J2和孢囊（新生孢囊+白色雌蟲）的數(shù)量以及1 g根組織中J2、J3和J4的數(shù)量，即不同蟲態(tài)的群體密度。利用Excel 2003軟件對各調(diào)查時期的線蟲群體密度，即線蟲群體動態(tài)，進行制圖；利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件（DPS 14.50）中的Duncan新復(fù)極差法對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。HGT在3種土壤濕度下侵染水平的評價采用繁殖系數(shù)（reproduction factor，Rf）法：Rf=孢囊最終群體密度（Pf）/孢囊初始群體密度（Pi），本試驗中Pi為6.7個/100 g土壤。

2 結(jié) 果

2.1 HGT 幼蟲群體動態(tài)

由圖1看出，接種線蟲后第10天，低濕度處理的土壤中未檢測到J2，而中、高濕度處理的土壤中存在J2。接種線蟲后第20天，低濕度處理的土壤中出現(xiàn)大量J2，而高濕度處理的土壤中J2群體密度最小。接種線蟲后第30天，低和中濕度處理的土壤中J2群體密度均達其高峰值，而高濕度處理的土壤中也存在較大數(shù)量J2（圖1）。

由圖2看出，接種線蟲后第10天，低濕度處理的煙草根組織中未檢測到J2，而中和高濕度處理的已出現(xiàn)J2，高濕度處理的J2群體密度最大。接種線蟲后第20天，低濕度處理的根組織中才開始出現(xiàn)J2，且J2群體密度最大。接種線蟲后第35天，低和中濕度處理的根組織中J2群體密度達其高峰值。接種線蟲后第10天和第20天（HGT世代進程的前中期，下同），低、中和高濕度處理的煙草根組織中J2平均群體密度分別為5.3、7.4和8.9個/g根，侵入量依次增加。

由圖3看出，接種線蟲后第10天，低濕度處理的煙草根組織中未檢測到J3，而中和高濕度處理的已出現(xiàn)J3，高濕度處理的J3群體密度最大。接種線蟲后第20天，低濕度處理的根組織中才開始出現(xiàn)少量J3。低、中和高濕度處理的根組織中J3發(fā)育高峰分接出現(xiàn)在接種后第35天、第20天和第20天。接種線蟲后第10天和第20天，低、中和高濕度處理的煙草根組織中J3平均群體密度分別為4.3、37.2和54.7個/g根，J3發(fā)育量依次增加。

由圖4看出，接種線蟲后第10天，3種濕度處理的煙草根組織中均未檢測到J4。接種線蟲后第20天，3種濕度處理的根組織中均出現(xiàn)J4。低、中和高濕度處理的根組織中J4發(fā)育高峰分接出現(xiàn)在接種后第35天、第30天和第20天。接種線蟲后第10天和第20天，低、中和高濕度處理的煙草根組織中J4平均群體密度分別為0.6、1.2和2.6個/g根，J4發(fā)育量依次增加。

圖1 煙草孢囊線蟲2齡幼蟲(J2)在土壤中的群體動態(tài)Fig. 1 Population dynamics of the 2nd stage juveniles of tobacco-infecting cyst nematode in soil

圖2 煙草孢囊線蟲2齡幼蟲(J2)在根組織中的群體動態(tài)Fig. 2 Population dynamics of the 2nd stage juveniles of tobacco-infecting cyst nematode in roots

圖3 煙草孢囊線蟲3齡幼蟲(J3)在根組織中的群體動態(tài)Fig. 3 Population dynamics of the 3rd stage juveniles of tobacco-infecting cyst nematode in roots

圖4 煙草孢囊線蟲4齡幼蟲(J4)在根組織中的群體動態(tài)Fig. 4 Population dynamics of the 4th stage juveniles of tobacco-infecting cyst nematode in roots

從以上結(jié)果可以看出，與中濕度處理相比，低濕度處理下，HGT J2在土壤中的孵化和對根系的侵入均受到抑制，根組織中J3和J4發(fā)育量明顯減少且發(fā)育進程延遲；高濕度處理下，HGT J2對煙草根系的侵入加快，根組織中J3和J4的發(fā)育提前。

2.2 HGT新生孢囊群體動態(tài)

由圖5看出，接種線蟲后第10天，3種濕度處理的煙草土壤中均未檢測到新生孢囊（含白色雌蟲，下同）。接種線蟲后第20天，3種濕度處理的新生孢囊均已出現(xiàn)，高濕度處理的新生孢囊群體密度最大。之后，3種濕度處理的新生孢囊群體密度均呈上升趨勢，均于接種后第35天達發(fā)生高峰，低、中和高濕度處理的高峰值分別為4.7個、6.8個和2.4個/100 g土壤，即各自濕度處理的HGT孢囊最終群體密度（Rf）。本試驗中孢囊初始群體密度（Pi）均為6.7，由此推算，低、中和高濕度處理下HGT的繁殖系數(shù)分別為0.7、1.0和0.4。

試驗同時發(fā)現(xiàn)，3種濕度處理的白色雌蟲最大群體密度出現(xiàn)在接種后第30天。

圖5 煙草孢囊線蟲新生孢囊在土壤中的群體動態(tài)Fig. 5 Population dynamics of the newly-formed cysts of tobacco-infecting cyst nematode in soil

3 討 論

在20.0和22.2 ℃條件下，大豆孢囊線蟲（Heterodera glycines）在大豆上完成1個世代需要22～37 d[11]；侵染煙草的大豆孢囊線蟲（HGT）在田間煙草上可以完成4個世代，平均世代歷期27 d[12]。本研究中，在土壤中濕度（體積含水量15%～25%）下，HGT于接種后第20天出現(xiàn)J3發(fā)育盛期，于接種后第30天出現(xiàn)J4發(fā)育和白色雌蟲形成盛期，并于接種后第30天和第35天分別出現(xiàn)J2土壤孵出和根系侵入高峰，表明于接種后30 d HGT已基本完成了1個世代，符合其世代發(fā)生規(guī)律。在土壤高濕度（體積含水量30%～40%）下，HGT雖然在前中期有較快的侵入和根內(nèi)發(fā)育，且J3和J4發(fā)育量最大，但最終形成的孢囊（或雌蟲）卻最少，繁殖系數(shù)（Rf）不到中濕度下Rf的50%，究其原因，可能由于較長期的高濕脅迫[7,13-14]和/或土壤較長期高濕條件致使煙堿在根系中大量積累而對根內(nèi)線蟲產(chǎn)生毒害作用[9,15]，導致根內(nèi)大部分J4無法成功發(fā)育為雌蟲。土壤水分過飽和條件下，可造成O2含量過低、CO2大量積累和（或）毒素增加，對線蟲和植物產(chǎn)生傷害[16]，勢必影響線蟲的繁殖。例如Singh等[17]研究發(fā)現(xiàn)，木豆孢囊線蟲（Heterodera cajani）在重量含水量24%下繁殖良好，Rf高達19.4，而在重量含水量40%下繁殖明顯受到抑制，Rf僅為0.4。

線蟲在土壤中的活動離不開水，土壤干燥勢必影響其存活、孵化、移動和侵染。砂質(zhì)粘壤土當重量含水量為7.2%～13.0%時，腎狀腎形線蟲（Rotylenchulus reniformis）能夠很好侵染大豆，當其為3.4%～5.8%時侵入量明顯下降[18]；當土壤體積含水量為9.6%時，小麥孢囊線蟲（Heterodera avenae）病情指數(shù)為88.7，當其為4.7%時病情指數(shù)低于60.0[19]；我國膠東地區(qū)3—4月持續(xù)嚴重干旱，導致非灌溉麥田小麥孢囊線蟲群體明顯下降[20]；大豆生長季前期土壤持續(xù)干旱，導致大豆孢囊線蟲第1代發(fā)生量小而不明顯，且與第2代世代重疊嚴重[21]。從以上研究結(jié)果看出，土壤缺水對線蟲侵染和繁殖不利；而本研究則進一步表明，土壤低濕度（體積含水量3%～9%）下，HGT的孵化和侵入受到抑制，根內(nèi)線蟲發(fā)育延遲，Rf有所下降。此外，從本研究結(jié)果可以推測，較長時間土壤高濕比一般性土壤干旱對HGT的抑制效果更加明顯，而土壤濕度適中或土壤時而干旱時而潮濕有利于HGT的發(fā)生和危害。

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Comparison of the Infection Characteristics of Tobacco-infecting Cyst Nematode among Three Soil Moisture Conditions

XU Guantang, ZHAO Honghai*

(College of Agronomy and Plant Protection, Qingdao Agricultural University, Key Laboratory of Integrated Crop Pest Management of Shandong Province, Qingdao 266109, China)

The purpose of this study was to investigate the effects of soil moisture on the infection of tobacco-infecting cyst nematode (Heterodera glycines, HGT). In the study, quantitative inoculation and cup experiment were conducted, and population densities and dynamics of different HGT developmental stages under three soil moisture treatments, the low one with the moisture volume percentage (MVP) of 3%-9%, the middle one with the MVP of 15%-25% and the high one with the MVP of 30%-40%, were ascertained through periodical sampling and microscopic examination of the juveniles, white females and newly-formed cysts extracted from soil and the juveniles stained in tobacco roots. The results showed that the emergence in soil and penetration to root of HGT 2nd stage juveniles were both inhibited, and the developmental quantities and processes of the 3rd and 4th stage juveniles were obviously decreased and delayed under the low moisture treatment as compared with the middle one. The penetration to root of the 2nd stage juveniles were speeded up and the development of the 3rd and 4th stage juveniles occurred ahead of time under the high moisture treatment as compared with the middle one. The reproduction factors (Rf) of HGT were 0.7, 1.0 and 0.4 under the low, middle and high moisture treatments, respectively. It could be concluded that both too low and excessive soil moistures were unfavorable for the normal infection of HGT, and excessive moisture inhibited the reproduction of HGT more obviously.

tobacco-infecting cyst nematode; moisture treatment; developmental process; reproduction factor

S435.72

1007-5119（2016）06-0055-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.06.010

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201503114）；青島農(nóng)業(yè)大學大學生科研創(chuàng)新項目（2014-193）；山東省普通本科高校應(yīng)用型人才培養(yǎng)專業(yè)發(fā)展支持計劃項目（lj20141811）

許冠堂（1994-），男，本科，從事孢囊線蟲研究。E-mail：2389996818@qq.com。*通信作者，E-mail：hhzhao@qau.edu.cn

2016-02-17

2016-07-18