冀書娟　康　康　李　浩

河南信陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科　信陽　464000

姜黃素對AD小鼠海馬神經(jīng)元凋亡和GSK-3β表達(dá)及磷酸化的影響

冀書娟康康李浩

河南信陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科信陽464000

【摘要】目的觀察姜黃素對AD小鼠模型海馬神經(jīng)元凋亡和糖原合成酶激酶3β表達(dá)及其磷酸化影響。方法將20只APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為AD模型組、AD模型+姜黃素組，每組10只，AD模型+姜黃素組腹腔注射劑量為400 mg/(kg·d)姜黃素，1次/d，連續(xù)14 d。取12只正常小鼠作對照組。采用掃描電鏡檢測小鼠海馬神經(jīng)元凋亡，Western blot 檢測GSK-3β、酪氨酸磷酸化GSK-3β(pTyr-GSK-3β)和絲氨酸磷酸化GSK-3β(pSer-GSK-3β)的表達(dá)情況。結(jié)果與對照組相比，模型組海馬神經(jīng)元出現(xiàn)染色質(zhì)邊集、線粒體腫脹、細(xì)胞器減少；pTyr-GSK-3β和pSer-GSK-3β的表達(dá)明顯增加(t=5.112，P=0.005；t=5.619，P=0.006)。與模型組相比，姜黃素組海馬神經(jīng)元染色質(zhì)呈彌散分布、線粒體嵴清晰可見、細(xì)胞器排列緊密，pTyr-GSK-3β表達(dá)明顯降低(t=-7.985，P=0.001)，pSer-GSK-3β表達(dá)明顯提高(t=9.105，P=0.001)。結(jié)論GSK-3β可能參與AD小鼠海馬神經(jīng)元損傷，姜黃素通過減少pTyr-GSK-3β、增加pSer-GSK-3β的表達(dá)抑制GSK-3β活性來減少AD小鼠海馬神經(jīng)元凋亡。

【關(guān)鍵詞】姜黃素；AD；海馬神經(jīng)元；糖原合成酶激酶-3β

阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease，AD)即老年癡呆，是一種慢性退行性神經(jīng)疾病，以記憶減退和認(rèn)知功能障礙為臨床特征[1]。目前，臨床上缺乏有效的治療AD的藥物，且不良反應(yīng)較強(qiáng)，因此研發(fā)不良反應(yīng)小的AD治療藥成為研究的熱點(diǎn)[2-3]。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，研究表明，GSK-3β可能與AD密切相關(guān)[4]。但姜黃素對AD引起的海馬神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用是否與GSK-3β相關(guān)，目前尚不清楚[2，5-6]。本實(shí)驗(yàn)初步探討姜黃素對AD小鼠海馬神經(jīng)元凋亡和GSK-3β表達(dá)及其pTyr-GSK-3β和pSer-GSK-3β蛋白表達(dá)的影響，為AD治療提供新的靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠20只及同齡正常小鼠10只，由天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1個(gè)月。

1.2主要試劑及儀器姜黃素、鼠抗人GSK-3β一抗、兔抗人pTy-GSK-3β一抗、兔抗人pSer-GSK-3β一抗、DAB顯色試劑盒購自天津化學(xué)試劑公司。掃描電鏡、電泳儀、光密度掃描儀購自美國。

1.3動(dòng)物分組及處理將20只APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為2組，即AD模型組、AD模型+姜黃素組，AD模型+姜黃素組腹腔注射姜黃素，濃度為400 mg/(kg·d)，1次/d，連續(xù)14 d。同時(shí)選取10同齡正常小鼠做為對照組。

1.4檢測指標(biāo)及方法

1.4.1細(xì)胞凋亡檢測：應(yīng)用掃描電鏡檢測神經(jīng)元凋亡，操作步驟取材、固定→切片(40 μm)→餓酸固定→脫水→樹脂包埋→超薄切片→電鏡觀察。

1.4.2Western blot檢測GSK-3β、pTyr-GSK-3β和pSer-GSK-3β表達(dá)檢測蛋白表達(dá)：-80 ℃取出腦組織，取50mg，提取總蛋白，蛋白含量測定，電泳→轉(zhuǎn)?！忾]→一抗→孵育洗滌→二抗→顯色→熒光系統(tǒng)掃描→分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組海馬神經(jīng)元凋亡情況比較與對照組相比，模型組海馬神經(jīng)元染色質(zhì)出現(xiàn)邊集，線粒體腫脹、嵴減少、出現(xiàn)空泡；與模型組相比，姜黃素組海馬神經(jīng)元核膜較清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，線粒體嵴較清晰。見圖1。

圖1　3組掃描電鏡情況比較

2.2各組GSK-3β、pTyr-GSK-3β和pSer-GSK-3β蛋白表達(dá)的比較與對照組相比，模型組GSK-3β總量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.975，P=0.412)，pTyr-GSK-3β和pSer-GSK-3β表達(dá)水平均明顯升高(t=5.112，P=0.005；t=5.619，P=0.006)；與模型組相比，姜黃素組GSK-3β表達(dá)水平差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.37，P=0.19)；姜黃素組pTyr-GSK-3β表達(dá)水平明顯降低(t=-2.994，P=0.017)，pSer-GSK-3β表達(dá)水平明顯升高(t=4.009，P=0.017)。見表1、圖2。

表1　各組GSK-3β、pTyr-GSK-3β、pSer-GSK-3β

注：與對照組比較，?P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

圖2　各組GSK-3β、pTyr-GSK-3β、PSer-GSK-3β蛋白表達(dá)

3討論

姜黃素是中藥姜黃中的有效成分，現(xiàn)已證實(shí)其具有抗炎、抗氧化、抗衰老等作用，其對AD的保護(hù)作用近年來備受青睞[7-8]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AD小鼠模型的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯。我們給予AD小鼠400 mg/(kg.d)姜黃素，雖然未能完全消除AD引起的細(xì)胞凋亡，但其凋亡情況明顯好于模型組，與模型組比較，核膜、線粒體嵴較清晰，這一現(xiàn)象表明，姜黃素可能減少海馬神經(jīng)元的凋亡。

GSK-3β是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，具有廣泛的生理作用，參與細(xì)胞增值、凋亡等過程，分子量為47Kd。GSK-3β具有雙向調(diào)節(jié)的特性，第216位上的酪氨酸磷酸化使其活性增強(qiáng)，反之減弱；第9位上的絲氨酸磷酸化使其失活，反之增強(qiáng)[9-11]。GSK-3β的活性受到抑制或者失活，會(huì)抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開放[11-13]，阻止細(xì)胞色素C釋放到胞漿中，從而阻止casPase級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[14-15]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AD上調(diào)PTyr-G S K-3β和PSer-GSK-3β的表達(dá)，提示GSK-3β磷酸化參與海馬神經(jīng)元的AD損傷。姜黃素組的GSK-3β表達(dá)水平無明顯變化，但可上調(diào)PSer-GSK-3β和下調(diào)PTyr-GSK-3β的表達(dá)，提示姜黃素通過上調(diào)PS er-GSK-3β和下調(diào)PTyr-GSK-3β的表達(dá)而抑制GSK-3β的活性，從而減少AD海馬神經(jīng)元凋亡，減輕、延緩AD進(jìn)程。

4參考文獻(xiàn)

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(收稿2015-04-27)

【中圖分類號】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)09-0037-02