吳中華

(安徽省生物研究所，安徽 合肥　230088)

Triton X-114用于去除內(nèi)毒素的研究

吳中華

(安徽省生物研究所，安徽 合肥230088)

摘要：目的探討規(guī)模化生產(chǎn)原核表達(dá)重組蛋白的Triton X-114去除細(xì)菌內(nèi)毒素的方法與效果。方法以大腸桿菌表達(dá)的重組人干擾素α2b、重組人生長激素、重組葡激酶蛋白粗提液為原料，采用反復(fù)抽提相分離法，研究Triton X-114去除細(xì)菌內(nèi)毒素的效果。結(jié)果經(jīng)一次Triton X-114抽提，能夠去除蛋白粗提液中95%的細(xì)菌內(nèi)毒素，蛋白收率保持85%以上，蛋白性質(zhì)不受影響。結(jié)論Triton X-114反復(fù)抽提相分離法能夠有效地去除細(xì)菌內(nèi)毒素，適合于規(guī)?；酥亟M蛋白的生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：洗滌劑；內(nèi)毒素類；重組蛋白質(zhì)類/分離和提純

大腸桿菌因其遺傳背景清晰、操作簡便、表達(dá)量高，是大量制備結(jié)構(gòu)簡單、不需要糖基化的重組蛋白的首選表達(dá)系統(tǒng)[1]。在利用大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)治療性重組蛋白時(shí)，在破碎細(xì)菌獲得蛋白的同時(shí)細(xì)胞壁內(nèi)的內(nèi)毒素及生產(chǎn)操作產(chǎn)生的內(nèi)毒素大量釋放到蛋白溶液中[2-3]，內(nèi)毒素的去除是建立純化工藝時(shí)必須考慮的關(guān)鍵問題。細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分是脂多糖(LPS)，呈弱酸性，其等電點(diǎn)在6.0左右，與很多種蛋白的等電點(diǎn)接近；而且脂多糖能夠與某些堿性蛋白形成復(fù)合體，常規(guī)除去內(nèi)毒素的方法有超濾、柱層析、離子交換分離技術(shù)[4-6]，但由于內(nèi)毒素固有的生物特性，使得這些方法具有一定的局限性。

1990 年，Aida 等[7]首次報(bào)道了用Triton X-114 液相分離法去除重組蛋白溶液中內(nèi)毒素的方法，此后陸續(xù)有研究采用此方法來去除生物制品中的內(nèi)毒素， Triton X-114在生物制品生產(chǎn)中具有潛在的應(yīng)用前景[8-10]。

Triton X-114是一種非離子型表面活性劑，具有較低的臨界膠束濃度，在4 ℃能和水溶液互溶，并與脂多糖分子結(jié)合，25 ℃以上能攜帶脂多糖分子從水相中析出。利用Triton X-114的這一性質(zhì)，我們研究了適合于規(guī)模化重組蛋白生產(chǎn)的Triton X-114相分離去除細(xì)菌內(nèi)毒素的方法和效果。

1材料與方法

1.1材料重組人干擾素α2b(rhIFNα2b)、重組人生長激素(rhGH)、重組葡激酶(rSak)的基因工程菌均由安徽安科生物工程(集團(tuán))公司研發(fā)中心保存。Triton X-114(純度≥99%)購自SIGMA公司。發(fā)酵用蛋白胨和酵母提取物為OXOID產(chǎn)品。鱟試劑和內(nèi)毒素檢查用水均為湛江博康海洋生物有限公司產(chǎn)品(批號(hào)分別為1311260、1312050)，鱟試劑靈敏度由安徽省食品藥品檢驗(yàn)所再標(biāo)定，0.25 EU·mL-1；細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定院(批號(hào)1306151)。其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。各種層析填料購自Pharmacia公司，α干擾素單克隆抗體親和層析膠安徽安科公司研制制備。

1.2蛋白粗提液的制備菌體破碎前用生理鹽水洗滌2次。rhIFNα2b為可溶性表達(dá)，200 g菌體用1 000 mL 20 mmol·L-1pH7.0 磷酸鹽緩沖液懸浮后經(jīng)高壓勻漿法破碎，15 000 g離心15 min后，上清即為蛋白粗提液。

rhGH為胞周質(zhì)分泌型表達(dá)，200 g菌體用500 mL 含10%蔗糖的20 mmol·L-1pH7.0 磷酸鹽緩沖液懸浮30 min，6 000 g離心10 min菌體再用4 000 mL去離子水懸浮30 min，1 000 g連續(xù)流離心收集流出液，超濾濃縮至1 000 mL。

rSak為包含體方式表達(dá)，400 g菌體用600 mL 20 mmol·L-1pH7.0 磷酸鹽緩沖液懸浮后經(jīng)高壓勻漿法破碎，15 000 g離心10 min，棄上清。沉淀分成兩份,分別用600 mL含0.5% Triton X-110和0.5%Triton X-114的磷酸鹽緩沖液充分懸浮洗滌，重復(fù)3次，得rSak包含體，比較兩種洗滌方式對(duì)蛋白粗提液中內(nèi)毒素含量的影響。包含體用8 000 mL 6 mol·L-1鹽酸胍溶解后對(duì)20 mmol·L-1pH7.0 磷酸鹽緩沖液充分透析，15 000 g離心15 min后，上清用pH7.0 磷酸鹽緩沖液定容至1 000 mL，即為蛋白粗提液。

1.3Triton X-114抽提去除內(nèi)毒素Triton X-114抽提去除內(nèi)毒素的操作步驟為：在蛋白粗提液中加入1% Triton X-114，4 ℃磁力攪拌60 min，充分混溶；30 ℃水浴中放置40 min，不時(shí)攪拌；25 ℃ 15 000 g離心15 min，小心移出上層水相。Triton X-114抽提去除內(nèi)毒素試驗(yàn)，進(jìn)行兩個(gè)循環(huán)；提取過程中所用的玻璃器皿250 ℃烘烤45 min以上，塑料離心管用0.5 mol·L-1的NaOH浸泡1 h然后用注射用水洗涮干凈。

Triton X-114抽提去除內(nèi)毒素工藝過程中，Triton X-114的加入量(1%)、4 ℃磁力攪拌時(shí)間(60 min)和30 ℃水浴時(shí)間(40 min)這一參數(shù)組合值，是以小量rhIFNα2b蛋白粗提液為樣品，采用正交試驗(yàn)法測(cè)定這三種因子不同水平的組合對(duì)內(nèi)毒素去除率(E%)、蛋白回收率(P%)的綜合影響，而最終確定的。

1.4內(nèi)毒素含量測(cè)定和蛋白定量及性質(zhì)鑒定內(nèi)毒素含量的測(cè)定按《中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》(2010版) 凝膠半定量法檢測(cè)；蛋白定量采用Lowry法[11]。

抽提以后的蛋白粗提液進(jìn)行純化，注意觀察目標(biāo)蛋白在層析過程中的柱行為。最終的純化樣品，除測(cè)定內(nèi)毒素含量以外，SDS-PAGE鑒定純度，rhIFNα2b用細(xì)胞病變抑制法測(cè)定其抗病毒活性，rSak用平板溶圈法測(cè)定其纖維蛋白溶解活性，rhGH用高效液相色譜法測(cè)定保留時(shí)間[12]。

1.5Triton X-114對(duì)鱟試劑靈敏度的影響采用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，分別用內(nèi)毒素檢查用水配制成0.01%、0.1%的Triton X-114溶液，將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品配制成1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2 EU·mL-1梯度溶液，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶解后，在旋渦混合器上混合15 min，以后每一步稀釋前最少混合30 s[13]，各取0.1 mL加入含0.1 mL鱟試劑的反應(yīng)管，混勻后37 ℃保溫(60±2)min，倒置反應(yīng)管觀察凝固情況。

2結(jié)果

2.1Triton X-114和Triton X-110洗滌包含體對(duì)蛋白粗提液中內(nèi)毒素含量的影響提取rSak包含體，分別采用含0.5% Triton X-110或0.5% Triton X-114的磷酸鹽緩沖液洗滌包含體，復(fù)性以后蛋白粗提液中的內(nèi)毒素含量分別為12 500～25 000 EU·mg-1和7 500～15 000 EU·mg-1， Triton X-114洗滌較Triton X-110洗滌內(nèi)毒素下降明顯，蛋白濃度分別為5.64和5.89 g·L-1，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2Triton X-114的加入量、4℃磁力攪拌時(shí)間和30℃水浴時(shí)間對(duì)內(nèi)毒素去除率、蛋白回收率的影響參考已有文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)為：Triton X-114的加入量(V/V,%)設(shè)0.5%、1%和2%三個(gè)水平，4 ℃磁力攪拌時(shí)間設(shè)30、60和90 min，30℃水浴時(shí)間設(shè)20、40和60 min，對(duì)內(nèi)毒素去除率(E)和蛋白回收率(P)的影響結(jié)果見表1。

表1　Triton X-114加入量、4 ℃磁力攪拌時(shí)間和30 ℃水浴時(shí)間對(duì)內(nèi)毒素去除率、蛋白回收率的影響

綜合考慮內(nèi)毒素去除率和蛋白回收率，確定Triton X-114加入量、4 ℃磁力攪拌時(shí)間和30 ℃水浴時(shí)間最佳水平組合為1%、60 min和40 min。

2.3Triton X-114相分離法去除細(xì)菌內(nèi)毒素的效果蛋白粗提液經(jīng) Triton X-114反復(fù)抽提2次，rhIFNα2b、rhGH、rSak第一次抽提內(nèi)毒素下降95%以上，第二次抽提內(nèi)毒素下降98%以上，測(cè)定結(jié)果見表2。

2.4Triton X-114抽提對(duì)蛋白含量和性質(zhì)的影響Triton X-114抽提前后，用Lowry法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)溶液體積及濃度的變化計(jì)算重組蛋白的回收率，rhIFNα2b、rhGH、rSak第一次抽提蛋白回收率85.5%以上，第二次抽提蛋白回收率85.6%以上，結(jié)果見表3。

注：泳道1：分子量標(biāo)記 ( 99.7ku,66.2 ku,45.0 ku,31.0 ku,20.5 ku,14.4 ku )；泳道2：rhIFNα2b 粗提液經(jīng)Triton X-114抽提后的純化樣品；泳道3：rhIFNα2b 粗提液經(jīng)未經(jīng)Triton X-114抽提后的純化樣品； 泳道4：rhGH粗提液經(jīng)Triton X-114抽提后的純化樣品；泳道5：rhGH粗提液未經(jīng)Triton X-114抽提后的純化樣品；泳道6：rSak粗提液經(jīng)Triton X-114抽提后的純化樣品；泳道7：rSak粗提液未經(jīng)Triton X-114抽提后的純化樣品。

圖1純化后重組蛋白電泳圖

2.5蛋白性質(zhì)鑒定Triton X-114抽提后，蛋白粗提液進(jìn)行純化，發(fā)現(xiàn)在層析過程中三種蛋白的柱行為沒有任何變化，純化后目標(biāo)蛋白純度(圖1)、純化過程中蛋白收率都與原工藝相當(dāng)。純化以后，三種重組蛋白的內(nèi)毒素含量均低于0.125 EU·mg-1，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]；rhIFNα2b抗病毒活性為1.2×108IU·mg-1， rSak的纖維蛋白溶解活性4.0×104RU·mg-1，與未經(jīng)Triton X-114抽提的純化樣品相比較沒有下降；rhGH RP-HPLC保留時(shí)間不變。

2.6Triton X-114對(duì)鱟試劑靈敏度的影響0.01% 和0.1% 的Triton X-114，使得鱟試劑的靈敏度從0.2～0.3 EU·mL-1分別下降至0.6～0.7 EU·mL-1和0.7～0.8 EU·mL-1。試驗(yàn)結(jié)果見表3。

3討論

3.1Triton X-114洗滌包含體對(duì)蛋白粗提液中內(nèi)毒素含量的影響包含體是大腸桿菌高效表達(dá)外源蛋白一種常見的形式。除重組蛋白外，包含體中還有核糖體蛋白和RNA、其它來源的雜蛋白以及內(nèi)毒素組分脂多糖等。包含體提取過程中的洗滌步驟，是用含有非離子表面活性劑(最常用的則是Triton X-110)的溶液，盡可能地去除細(xì)胞碎片和附著在包含體顆粒表層的一些雜質(zhì)。分別用含0.5%Triton X-110和0.5%Triton X-114洗滌液洗滌包含體，復(fù)性以后蛋白粗提液中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量雖然存在一定的差異(12 500～25 000 EU·mg-1vs7 500～15 000 EU·mg-1)，但效果并不十分顯著。這是因?yàn)榘w的結(jié)構(gòu)十分致密，包裹于其內(nèi)部的內(nèi)毒素分子在洗滌過程中無法去除。

3.2Triton X-114相分離法去除細(xì)菌內(nèi)毒素的效果本研究結(jié)果顯示，采用Triton X-114相分離法，一次抽提就可以去除95%以上的細(xì)菌內(nèi)毒素，顯著降低重組蛋白溶液中的內(nèi)毒素含量。仔細(xì)分析數(shù)據(jù)還可以發(fā)現(xiàn)，在rhIFNα2b和rhGH的第二輪抽提、rSak的兩輪抽提過程中，內(nèi)毒素含量降低的幅度都在98%以上。這一結(jié)果，與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[15]。Triton X-114相分離法去除內(nèi)毒素的效果，顯然與蛋白溶液中內(nèi)毒素的含量、Triton X-114的加入量都有關(guān)系。實(shí)際上，在本研究進(jìn)行的過程中，我們也實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在一定的濃度范圍內(nèi)，Triton X-114 的加入量與內(nèi)毒素的去除效果呈正相關(guān)(結(jié)果未顯示)。我們選擇1%的Triton X-114加入量，是基于內(nèi)毒素去除效果和蛋白回收率兩方面的綜合考慮。因?yàn)樵诔樘徇^程中，蛋白溶液的濃度基本不會(huì)變化，但蛋白溶液的體積會(huì)減少，而且減少的幅度與Triton X-114的加入量成正比。本研究所采用的Triton X-114相分離抽提方法，蛋白收率在85%以上。抽提溶液離心以后，雖然下層有機(jī)相和上層水相之間界面清晰，但在移出上清溶液時(shí)為了確保下層Triton X-114不流出而導(dǎo)致污染，這一步驟樣品損失明顯。如果能在該步驟上做技術(shù)性改進(jìn)，則整個(gè)抽提過程的蛋白回收率會(huì)大幅度提高。而蛋白收率的提高，才能使得反復(fù)抽提成為可能。

表2　Triton X-114抽提去除內(nèi)毒素的效果

表3　Triton X-114抽提對(duì)蛋白含量的影響

表3　Triton X-114對(duì)鱟試劑靈敏度的影響

注：+:凝固(陽性)-:未凝固(陰性)。

Triton X-114本身為一種非離子性表面活性劑，不會(huì)對(duì)蛋白的性質(zhì)產(chǎn)生影響，重組蛋白只要能耐受Triton X-114抽提過程中的溫度條件，則都能適用于Triton X-114相分離技術(shù)以去除內(nèi)毒素。

3.3Triton X-114對(duì)鱟試劑靈敏度的影響采用相分離法去除內(nèi)毒素，上層水相蛋白溶液中總會(huì)殘留有極少量或者微量的Triton X-114。這些Triton X-114殘留，是否會(huì)嚴(yán)重地干擾鱟試劑法測(cè)定內(nèi)毒素的試驗(yàn)結(jié)果？本研究設(shè)計(jì)了一項(xiàng)試驗(yàn)，驗(yàn)證Triton X-114對(duì)鱟試劑靈敏度的影響，結(jié)果表明，0.01% 和0.1% 的Triton X-114，使得鱟試劑的靈敏度降低，從0.2～0.3 EU·mL-1分別下降至0.6～0.7 EU·mL-1和0.7～0.8 EU·mL-1。

0.01% 和0.1%的 Triton X-114使鱟試劑的靈敏度降低了2～4倍， 而Triton X-114抽提前后內(nèi)毒素水平則相差20～50倍(95%～98%)；將內(nèi)毒素的去除與重組蛋白的純化工藝結(jié)合，初始濃度為1% Triton X-114，經(jīng)提取、透析、層析或離子交換等處理，殘留量可降至1 mg·L-1以下[14]，其最終測(cè)定液中的Triton X-114濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)地低于0.01%。由此可以得出結(jié)論，最終純化樣品中 Triton X-114殘留對(duì)鱟試劑的靈敏度基本無影響，但Triton X-114抽提去除細(xì)菌內(nèi)毒素的效果是不容置疑的。

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Removal of endotoxin by Triton X-114 phase separation

WU Zhong-hua

(BiologicalResearchInstitute,Hefei,Anhui230088,China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate an effective method to remove endotoxin with Triton X-114 phase separation for E.coli recombinant protein purifications.MethodsTriton X-114 phase separation was used to remove endotoxin from crude preparations of recombinant human interferon α2b,human growth hormone,and staphylokinase.ResultsThe reduction in endotoxin levels was greater than 95% with Triton X-114 phase separation,and recovery of the proteins after endotoxin removal was greater than 85%,meanwhile the characteristics of recombinant proteins did not change.ConclusionsTriton X-114 phase separation is a kind of effective method to remove endotoxin for large-scale E.coli recombinant protein purifications.

Key words:Detergents；Endotoxins；Recombinant Proteins/isolation & purification

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.05.009

(收稿日期：2015-12-15，修回日期：2016-03-08)