陳亨利，莫金龍，康元環(huán)，陳　龍，畢建飛，張冬星，李芳芳，李　影，單曉楓（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

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維氏氣單胞菌滅活疫苗的制備及對(duì)錦鯉免疫效果評(píng)價(jià)

陳亨利，莫金龍，康元環(huán)，陳龍，畢建飛，張冬星，李芳芳，李影，單曉楓
（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

摘要：為證明維氏氣單胞菌滅活疫苗對(duì)錦鯉機(jī)體的免疫效果，應(yīng)用福爾馬林滅活法制備了維氏氣單胞菌滅活疫苗對(duì)免疫后的錦鯉進(jìn)行酸性磷酸酶活力檢測(cè)、超氧化物歧化酶活力檢測(cè)、吞噬活力等各項(xiàng)免疫指標(biāo)的檢測(cè)，并于試驗(yàn)第5周進(jìn)行免疫保護(hù)力試驗(yàn)。結(jié)果顯示，酸性磷酸酶活力在試驗(yàn)開始后有所上升，在第2周達(dá)到最高；超氧化物歧化酶活力上升，并在第2周達(dá)到最高；經(jīng)觀察，第3周開始白細(xì)胞的數(shù)量增多，吞噬活性同時(shí)增大；抗體效價(jià)于第3周達(dá)到最大值，并持續(xù)一段時(shí)間；免疫4周后攻菌檢測(cè)免疫保護(hù)力，測(cè)得試驗(yàn)組的相對(duì)免疫保護(hù)率RPS為86.4%。上述結(jié)果表明，維氏氣單胞菌滅活疫苗能夠誘導(dǎo)錦鯉機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，并能形成一定保護(hù)力。

關(guān)鍵詞：維氏氣單胞菌；滅活疫苗；錦鯉；免疫效果

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii），屬氣單胞菌科（Aeromonadaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas），為一種新型人魚共患病原菌，能夠生存于淡水、海水及污泥中，可引起包括鯉（Cyprinuscarpio）[1]、鯽魚（Carassiusauratus）[2]、黃顙魚（Pelteobagrusful?vidraco）[3]、烏鱧（Ophicephalus argus）[4]等多種經(jīng)濟(jì)魚和觀賞魚的疾病，通常表現(xiàn)為病死魚出現(xiàn)腹水及消化道出血，也可引起人類的腹瀉甚至敗血癥[5-7]。

滅活疫苗因其安全性好，制備方法簡(jiǎn)便、快捷，儲(chǔ)存、運(yùn)輸要求低，受母源抗體的影響小等諸多優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用[8]。維氏氣單胞菌滅活疫苗在國內(nèi)研究報(bào)道甚少，李正偉[9]研究的維氏氣單胞菌滅活疫苗對(duì)草魚及鯽魚有較好的免疫保護(hù)性。本試驗(yàn)通過甲醛滅活維氏氣單胞菌，制備維氏氣單胞菌滅活疫苗，并通過酸性磷酸酶活力檢測(cè)、超氧化物歧化酶活力檢測(cè)、吞噬活力等指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)維氏氣單胞菌菌株滅活疫苗的免疫效果。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株及試驗(yàn)動(dòng)物維氏氣單胞生物菌JLL-1菌株，由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；金黃色葡萄球菌，由本實(shí)驗(yàn)室保存；健康錦鯉，體長(zhǎng)約為15 cm，體重約為80～90 g，購自長(zhǎng)春市某養(yǎng)殖場(chǎng)，飼養(yǎng)于消毒水族箱中，水體保持28℃恒溫，過濾，供氧，并每隔3 d更換水族箱體積2/3的水以保證水質(zhì)良好。

1.1.2主要試劑胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉（購自英國Oxoid公司）；甲醛（購自北京化工廠）；RS瓊脂（購自北京陸橋生物技術(shù)責(zé)任有限公司）；酸性磷酸酶檢測(cè)試劑盒及超氧化物歧化酶檢測(cè)試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）；肝素鈉及瑞氏吉姆薩染色液（購自北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.3滅活疫苗的制備條件優(yōu)化制備1×108CFU/mL的菌液并分裝于試管中，按照甲醛濃度分別為0.05%，0.10%，0.20%，0.30%的劑量加入到各管中，每種濃度兩管，并將不同濃度的甲醛菌液置于30℃恒溫培養(yǎng)箱及4℃低溫冰箱中，分別于第6、7、8、9、10、11、12小時(shí)每管取100 μL涂布于RS瓊脂上30℃倒置培養(yǎng)至24 h。觀察并記錄細(xì)菌生長(zhǎng)情況，以此判定JLL-1菌株的最佳滅活條件。

1.1.4魚體免疫試驗(yàn)將200尾錦鯉隨機(jī)分成2組，每組100尾，置于2個(gè)滅菌的28℃恒溫水族箱中。在對(duì)魚類進(jìn)行免疫前，將滅活疫苗用pH值7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次。試驗(yàn)組腹腔注射濃度為1×108CFU/mL的滅活疫苗，每尾0.2 mL。對(duì)照組腹腔注射pH值7.2的PBS，每尾0.2 mL。

在免疫前0周至免疫后第4周，每周從試驗(yàn)組和對(duì)照組中分別隨機(jī)選取10尾錦鯉，并用適量丁香油將其麻醉[10-11]，進(jìn)行尾靜脈采血，采血后的魚淘汰處理。制得魚血清于-20℃冰箱中凍存，備用。

1.1.5酸性磷酸酶活力（ACK）檢測(cè)反應(yīng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行，具體操作見南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的酸性磷酸酶活力檢測(cè)試劑盒，并按說明書中公式計(jì)算各組酶活力。

1.1.6超氧化物歧化酶（SOD）活力檢測(cè)反應(yīng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行，具體操作見南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的超氧化物歧化酶活力檢測(cè)試劑盒，并按說明書中公式計(jì)算各組SOD活力。

1.1.7白細(xì)胞吞噬活性檢測(cè)參照范秀榮[12]等人的方法，隨機(jī)觀察100個(gè)白細(xì)胞，計(jì)算白細(xì)胞吞噬百分比（PP）及白細(xì)胞吞噬指數(shù)（PI）。

1.1.8抗體效價(jià)測(cè)定采用傳統(tǒng)的試管凝集法檢測(cè)血清抗體水平，倍比稀釋法將0.1 mL待檢血清樣本用0.9%生理鹽水稀釋至第10管，每管0.5 mL，并在1-10管中分別加入用0.85%生理鹽水洗滌稀釋的JLL-1菌液（1×108CFU/mL）0.5 mL。將試管置于30℃恒溫培養(yǎng)箱，12 h，取出，室溫放置3 h，觀察細(xì)菌凝集程度。

1.1.9免疫保護(hù)率測(cè)定免疫4周后，對(duì)試驗(yàn)組及對(duì)照組剩余的各50尾錦鯉進(jìn)行腹腔注射攻菌，攻菌菌液為0.85%生理鹽水稀釋的JLL-1菌液，濃度為2×107CFU/mL，每尾0.2 mL，連續(xù)觀察14 d，期間正常飼喂，換水。記錄各組錦鯉死亡數(shù)，計(jì)算出相對(duì)免疫保護(hù)率（RPS）。

2　結(jié)果

2.1滅活疫苗條件通過測(cè)得菌液在不同條件的生長(zhǎng)情況，最后得出結(jié)論：甲醛濃度為0.05%，在4℃下，滅活12 h。經(jīng)安全試驗(yàn)滅活疫苗被完全滅活。

2.2酸性磷酸酶（ACP）活力檢測(cè)結(jié)果波長(zhǎng)520 nm酶標(biāo)儀測(cè)定各孔數(shù)值后，根據(jù)公式，計(jì)算各組酸性磷酸酶ACP數(shù)值，并經(jīng)SPSS分析，得出試驗(yàn)組及對(duì)照組酸性磷酸酶（ACP）變化趨勢(shì)及差異。試驗(yàn)組ACP活力由免疫前的29.26金氏單位/mL開始上升，在免疫第1周達(dá)到88.73金氏單位/mL，在第2周到達(dá)最大值104.6金氏單位/mL，在第3周下降到61.9金氏單位/mL，在第4周下降到36.23金氏單位/ml，對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)的ACP活力保持在27.41金氏單位/mL～35.72金氏單位/ml范圍內(nèi)，變化不顯著。

2.3超氧化物歧化酶（SOD）活力檢測(cè)結(jié)果波長(zhǎng)450 nm酶標(biāo)儀測(cè)定各孔數(shù)值后，根據(jù)公式，計(jì)算各組超氧化物歧化酶SOD數(shù)值，并經(jīng)SPSS分析，得出試驗(yàn)組及對(duì)照組超氧化物歧化酶變化趨勢(shì)及差異。試驗(yàn)組SOD活力由免疫前的132.84 U/mL開始上升，在免疫第1周達(dá)到205.96 U/mL，在第2周到達(dá)最大值224 U/mL，在第3周下降到179.72 U/ mL，在第4周下降到173.03 U/mL，對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)的SOD活力保持在129.57 U/mL～149.03 U/mL范圍內(nèi)，變化不顯著。

2.4白細(xì)胞吞噬活性

2.4.1白細(xì)胞吞噬百分比（PP）顯微鏡鏡檢，并隨機(jī)觀察100個(gè)白細(xì)胞的吞噬情況，并求3組平行試驗(yàn)的平均值，白細(xì)胞吞噬顯微照片，（見中插彩版圖3）。試驗(yàn)組的吞噬百分比（PP）在0周時(shí)為13%與對(duì)照組14.67%無差異，試驗(yàn)組免疫后第1周上升為17%，第2周繼續(xù)上升到22.33%，在第3周時(shí)達(dá)到最大值36.67%，而第4周在第3周基礎(chǔ)上下降至25%。而對(duì)照組變化不明顯。

2.4.2白細(xì)胞吞噬指數(shù)（PI）顯微鏡鏡檢并隨機(jī)觀察100個(gè)白細(xì)胞的吞噬情況，根據(jù)公式計(jì)算其PI值，并求3組平行試驗(yàn)的平均值，試驗(yàn)組的吞噬指數(shù)（PI）在0周時(shí)為1.47，與對(duì)照組1.37無差異，試驗(yàn)組免疫后第1周上升到1.50，第2周繼續(xù)上升到2.07，在第3周時(shí)達(dá)到最大值2.91，而第4周在第3周基礎(chǔ)上略下降至2.25。而對(duì)照組變化不明顯。

2.5抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果根據(jù)方法1.2.8，采用傳統(tǒng)的試管凝集法，測(cè)得試驗(yàn)組的抗體效價(jià)呈上升趨勢(shì)，免疫前0周抗體效價(jià)為1∶40，在第1周上升到1∶160，在第2周呈2倍上升，抗體效價(jià)為1∶320，而在第3周達(dá)到最大值1∶1 280，第4周下降到1∶640，但仍高于對(duì)照組，而對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)的抗體效價(jià)均為1∶40。

2.6免疫保護(hù)率檢測(cè)結(jié)果免疫4周后，進(jìn)行攻菌試驗(yàn)，重復(fù)3次。在連續(xù)觀察14 d后，試驗(yàn)組平均死亡率為12.33%，對(duì)照組平均死亡率為82.33%，差異極顯著（P<0.0001）。根據(jù)公式計(jì)算出試驗(yàn)組的相對(duì)免疫保護(hù)率RPS為85.02%。

圖1　ACP活力變化趨勢(shì)

圖2　SOD活力變化趨勢(shì)

圖4　白細(xì)胞吞噬指數(shù)（PI）變化趨勢(shì)

圖5　抗體效價(jià)變化趨勢(shì)

圖6　免疫保護(hù)率檢測(cè)

3　討論

維氏氣單胞菌作為近年來新發(fā)現(xiàn)的一種人魚共患病病原菌，廣泛存在于水體環(huán)境中，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)來說是一種新的威脅。國內(nèi)對(duì)維氏氣單胞菌的研究相對(duì)較少，因而不易確診。魚用疫苗發(fā)展較畜牧業(yè)晚，在生產(chǎn)中應(yīng)用的最多的是滅活疫苗。研究應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室保存的維氏氣單胞菌JLL-1株作為試驗(yàn)材料，采用福爾馬林滅活法進(jìn)行滅活疫苗制備，最終確定0.05%甲醛濃度，4℃作用12 h為最佳滅活條件，能夠徹底殺滅細(xì)菌的同時(shí)，最大程度保留病原菌的免疫原性。

試驗(yàn)中，經(jīng)檢測(cè)，在免疫后的3周內(nèi)，試驗(yàn)組與對(duì)照組的ACP活力相比，差異均極顯著（P<0.0001），第4周試驗(yàn)組ACP活力下降，但仍與對(duì)照組呈顯著性差異（P<0.01或P<0.05）。免疫組ACP活力呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，并在第2周時(shí)達(dá)到最大值，這可能是由于機(jī)體需要一定的時(shí)間來產(chǎn)生酸性磷酸酶。2周后大部分抗原被機(jī)體清除后，ACP活力逐漸下降但仍高于對(duì)照組。ACP可能在動(dòng)物的細(xì)胞增殖分化、免疫調(diào)節(jié)等過程起重要作用[13]，可見，對(duì)錦鯉腹腔注射滅活的JLL-1菌液，能夠顯著增強(qiáng)機(jī)體ACP的活力，進(jìn)而起到提高免疫效果的作用。

錦鯉在注射維氏氣單胞菌滅活疫苗后，SOD活力從第1周開始相對(duì)于對(duì)照組呈上升趨勢(shì)，在第2周達(dá)到最大值，免疫后各周SOD活力均與對(duì)照組呈極顯著性差異（P<0.0001）。SOD是體內(nèi)一種重要的可清除自由基的物質(zhì)，SOD活力的提高證明該滅活疫苗能夠有效加強(qiáng)機(jī)體對(duì)外來物質(zhì)的清除作用。

在對(duì)錦鯉免疫后，白細(xì)胞的吞噬指數(shù)（PI）和吞噬百分比（PP）在免疫的第2周開始，直到免疫的第4周內(nèi)，均和對(duì)照組呈極顯著差異（P<0.0001）。而在免疫第1周，吞噬百分比（PP）與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05），吞噬指數(shù)（PI）與對(duì)照組呈顯著差異（P<0.01或P<0.05）。PP及PI的變化呈一定的正相關(guān)性，說明白細(xì)胞數(shù)量增多的同時(shí)，吞噬病原菌的能力也在增強(qiáng)。由于白細(xì)胞分化需要一定的時(shí)間，因此，在免疫的第1周，對(duì)照組和試驗(yàn)組吞噬白細(xì)胞的數(shù)量增加的并不顯著，而試驗(yàn)組中滅活疫苗刺激了原有白細(xì)胞的活性，使試驗(yàn)組白細(xì)胞吞噬細(xì)菌的數(shù)量有所增加。

試驗(yàn)過程中，免疫組錦鯉的抗體效價(jià)呈先上升后下降的趨勢(shì)，并在第3周達(dá)到最大值1∶1 280，并且免疫后第2周至第4周內(nèi)，試驗(yàn)組抗體效價(jià)均與對(duì)照組呈極顯著差異（P<0.0001）。由于魚類抗體的形成期比哺乳動(dòng)物要長(zhǎng)，因此錦鯉血清抗體效價(jià)在第3周時(shí)才達(dá)到最高峰，并在第4周時(shí)仍維持在較高的水平。

本試驗(yàn)只測(cè)定了一免后各項(xiàng)指標(biāo)的變化，二次免疫對(duì)錦鯉免疫性能的影響有待進(jìn)一步的研究。免疫4周后，試驗(yàn)組的相對(duì)免疫保護(hù)率為85.03%，且各組試驗(yàn)均證明，維氏氣單胞菌JLL-1株滅活疫苗能夠使錦鯉產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫力，在一定程度上能夠促進(jìn)錦鯉抵抗維氏氣單胞菌的感染。

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Preparation of Aeromonasveronii inactivated vaccineand evaluateof immuneeffect on koi

CHEN Heng-li，MO Jin-long，KANG Yuan-huan，CHEN Long，BI Jian-fei，ZHANG Dong-xing，LI Fang-fang，LI Ying，SHAN Xiao-feng
（College of animal science and technology，jilin agricultural university，Changchun 130118，China）

Abstract：To prove the immune effect of the inactivated vaccine against Aeromonas veronii on koi，we made the formalinkilled Aeromonas veronii vaccine，which were used for the test of acid phosphatase activity，superoxide dismutase activity detection and phagocytic activity on vaccinated koi .The immune protection experiment was conducted on the 5thweek .The results showed that the activity of acid phosphatase increased and reached the peak point on 2ndweek . The activity of superoxide dismutase in?creased and reached the peak point on the 2ndweek.We observed that the number of leukocytes increased on the 3rdweek，mean?while，the activity of phagocytic increased.The antibody titer reached the maximum on the 3rdweek and lasted for a long time.On the 4thweek post-immunization，the fish were challenged with Aeromonas veronii to detect the protective effects of the vaccine，and it was found that the immune protective rate was 86.4% in the experimental group.In conclusion，Aeromonas veronii inactivated vac?cine can prevent the koi from Aeromonas veronii，and formed the immune protection.

Key words：Aeromonas veronii；inactivated vaccine；koi；immune effect Corresponding authors：SHAN Xiao-feng；LI Ying

中圖分類號(hào)：S852.61

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529-6005（2016）05-0110-04

收稿日期：2015-03-31

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201927）；吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（20150204065NY）

作者簡(jiǎn)介：陳亨利（1991-），男，碩士，從事動(dòng)物微生物學(xué)研究，E-mail：ch19108@163.com

通訊作者：?jiǎn)螘詶鳎珽-mail：sxf1997@163.com；李影，E-mail：thliying@163.com