馬　霞，王長林，郭振環(huán)，劉永錄，沈志強（.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，河南鄭州4500；.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州56600）

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納米蜂膠黃酮體內(nèi)外抗PPV活性試驗

馬霞1，2，王長林1，郭振環(huán)2，劉永錄1，沈志強2
（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，河南鄭州450011；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

摘要：采用體內(nèi)外試驗研究納米蜂膠黃酮抗豬細(xì)小病毒活性。體外試驗，以普通蜂膠黃酮為對照，分3種加藥方式（先加蜂膠，后加蜂膠，蜂膠和病毒同時加入）加至PK-15細(xì)胞中，用MTT法檢測細(xì)胞活性，實時熒光PCR檢測PK-15細(xì)胞中豬細(xì)小病毒（PPV）含量，觀察蜂膠黃酮對PK-15細(xì)胞抗PPV及清除PPV能力的影響。結(jié)果顯示，與普通蜂膠黃酮相比，納米蜂膠黃酮可顯著抑制PPV在PK-15細(xì)胞上生長，高濃度效果優(yōu)于低濃度，3種加藥方式中先加藥物的效果最好。體內(nèi)試驗，豚鼠注射PPV后灌胃納米蜂膠黃酮和普通蜂膠黃酮，檢測血液中PPV含量、血清中HI含量。結(jié)果顯示，高、中劑量的納米蜂膠黃酮可以顯著抑制PPV在血液中復(fù)制、減輕PPV對豚鼠體重的影響、提高血清HI效價。結(jié)論，普通蜂膠黃酮經(jīng)納米化處理后，可以顯著提高其抗PPV活性。

關(guān)鍵詞：納米蜂膠黃酮；豬細(xì)小病毒；體內(nèi)；體外；抗病毒活性

蜂膠是一種蜜蜂從植物樹干及花苞上采集并混入其上顎腺分泌物和蜂蠟等物質(zhì)而成的具有芳香氣味的膠狀固體物質(zhì)。其有效成分主要是黃酮類化合物。蜂膠黃酮具有抗病毒、抗菌、抵氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[1-2]，蜂膠及其黃酮等有效成分經(jīng)過納米化處理可以進(jìn)一步提高其抗病毒、免疫增強、抗氧化等生物活性[3-4]。

本試驗在前期研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠乙醇提取物（黃酮成分為主）體外具有抗豬細(xì)小病毒（PPV）作用的基礎(chǔ)上[5]，對蜂膠黃酮進(jìn)行納米化處理，通過體內(nèi)外試驗比較其納米化前后抗豬細(xì)小病毒活性。

1　材料與方法

1.1毒株、細(xì)胞和實驗動物PPV-SD1毒株，山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院分離、鑒定后保存；豬腎原傳代細(xì)胞（Porcine kidney 15，PK-15），中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；健康豚鼠，體重350 g左右，購自北京中醫(yī)藥大學(xué)動物中心。

1.2主要試劑和儀器納米蜂膠黃酮（NPF）和普通蜂膠黃酮（PF），由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院蜂膠疫苗工程技術(shù)研究中心制備并提供；胰蛋白酶，DMEM培養(yǎng)基，均購自Gibco公司；新生牛血清，杭州四季青生物有限公司產(chǎn)品。熒光定量PCR儀（7300型），美國ABI公司；CO2培養(yǎng)箱（371型），Thermo公司生產(chǎn)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，德國Nunclon公司生產(chǎn)；倒置顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠生產(chǎn)。

1.3體外試驗將NPF和PF分別從安全濃度（500 μg/mL-1）開始倍比稀釋5個濃度。按先加蜂膠后加病毒（pre-adding pattern），先加病毒后加蜂膠（post-adding pattern），蜂膠和病毒感作2 h后同時加入（simultaneous adding pattern）3種方式加到長成單層PK-15細(xì)胞中，每濃度重復(fù)4孔，同時設(shè)病毒對照和細(xì)胞對照孔。培養(yǎng)72 h后MTT法測定細(xì)胞活性。實時熒光定量PCR檢測PK-15細(xì)胞體系中PPV含量[2]。

1.4體內(nèi)試驗160只豚鼠隨機均分為8組，1～7組肌肉注射104.5TCID50劑量的PPV攻毒，攻毒后1～3組和4～6組分別灌胃2、4、8 g/kg·d低中高劑量的NPF和PF，第7組攻毒對照組，第8組為空白對照組。攻毒后第3（D3）、7（D7）、14（D14）、21（D21）天，心臟采血，熒光定量PCR測定全血中PPV含量，β-微量法測定血清特異性HI-抗體，稱重觀察體重變化。

1.5數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)以X±SE表示，用SPSS 11.5軟件統(tǒng)計分析組間的差異性。

2　結(jié)果

2.1體外試驗

2.1.1體外抗病毒感染細(xì)胞活性在先加藥物方式中，NPF組在15.6～250 μg/mL范圍內(nèi)A570值顯著高于PF組和病毒對照組（P<0.05）；在后加藥物和藥物病毒作用后同時加入方式中，NPF組在31.2～250 μg/mL范圍內(nèi)A570值均顯著高于PF組和病毒對照組，PF組在125～250 μg/mL范圍內(nèi)A570值均顯著高于病毒對照組（P<0.05）（表1）。

表1　3種加藥方式各組細(xì)胞的A570值

表2　3種加藥方式各組PPV含量（×106/mL）

2.1.2體外抗病毒感染PK-15細(xì)胞中PPV含量在3種加藥方式中，NPF和PF組在31.2～250 μg/mL范圍內(nèi)PPV含量顯著低于病毒對照組（p<0.05）；在先加藥物方式中，NPF組在31.2～250 μg/mL范圍內(nèi)PPV含量顯著低于PF組（P<0.05）（表2）。

2.2體內(nèi)試驗

2.2.1攻毒后血液中PPV含量攻毒后D7、D14和D21，NPF和PF高中低劑量組血液中的PPV含量顯著低于病毒對照組，NPF高中低劑量組顯著低于PF組（P<0.05）（圖1）。

2.2.2攻毒后血清中HI含量在HI抗體效價指標(biāo)變化中，攻毒后D7，NPF高中劑量組的HI抗體效價顯著高于PF組和病毒對照組，PF高劑量組顯著高于病毒對照組（P<0.05）；攻毒后D14和D21，NPF和PF高中劑量組的HI抗體效價顯著高于病毒對照組，NPF高中劑量組顯著高于PF組（P< 0.05）（圖2）。

圖1　血液中PPV含量（×103/copies·μL）注：標(biāo)注不同字母者表示NPF或PF中各組差異顯著（P<0.05），*：NPF與PF中相應(yīng)組間差異顯著（P<0.05），下表同

圖2　攻毒后血清HI抗體含量變化

2.2.3攻毒后體重變化攻毒后D7，NPF和PF高劑量組的體重顯著低高于病毒對照組（P<0.05）；攻毒后D14和D21，NPF組高中劑量組與PF高劑量組顯著高于病毒對照組，NPF高中劑量組顯著高于PF組（P<0.05）（表3）。

表3　攻毒后各組體重變化

3　討論

體外試驗結(jié)果表明，NPF和PF均可提高PK-15在接種PPV后的細(xì)胞活性，減少PK-15細(xì)胞體系中的PPV含量，均具有降低PPV感染PK-15細(xì)胞的能力。濃度越高該作用效果越明顯，且以先加藥物的方式最好，NPF效果優(yōu)于PF。我們前期亦發(fā)現(xiàn)，蜂膠通過提高PK-15細(xì)胞活性和減少細(xì)胞體系中PPV含量而具有很好的抗PPV作用，且與濃度呈正相關(guān)[5]。

體內(nèi)試驗采用豚鼠觀察和比較了NPF和PF體內(nèi)抗PPV活性，結(jié)果表明，與病毒對照組相比，NPF 和PF體內(nèi)均可以顯著降低血液中PPV含量、提升血清HI抗體、減輕PPV對豚鼠體重的影響，并且NPF的綜合效果多優(yōu)于PF。推測NPF和PF通過提高特異性抗體發(fā)揮抗病毒作用，孔祥峰等在研究蜂膠黃酮抗新城疫病毒作用時亦有相似報道[6]。

本試驗發(fā)現(xiàn)，NPF的體內(nèi)抗PPV效果多顯著優(yōu)于PF。很多文獻(xiàn)亦報道經(jīng)納米化處理后可以提高藥物生物活性。Fan等研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠經(jīng)脂質(zhì)體處理后達(dá)到納米級可提高其免疫增強活性和抗氧化效果[3]。李雅晶等報道，與普通蜂膠比較，蜂膠經(jīng)納米化后可以顯著提高其對試驗性高血脂大鼠脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用，提高脂質(zhì)代謝的酶活性和降低甘油三酯和膽固醇濃度[7]。

參考文獻(xiàn)：

[1]顧青，張燕平，鐘立人.蜂膠中有效成分提取工藝研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2001，13（3）：161-163.

[2] Xia Ma，Zhenhuan Guo，Zhiqiang Shen，et al . The immune en?hancement of propolis adjuvant on inactivated porcine parvovirus vaccine in guinea pig [J].Cellular Immunology，2011，270，13-18.

[3] Yunpeng Fan，Lin Ma，Weimin Zhang，et al . Microemulsion can improve the immune-enhancing activity of propolis flavonoid on immunosuppression and immune response[J].International Journal Biollogical Macromolecules，2014，63：126-132.

[4] Yunpeng Fan，Lin Ma，Weimin Zhang，et al.The design of propo?lis flavone microemulsion and its effect onenhancing the immuni?ty and antioxidant activity in mice[J].International Journal Biollog?ical Macromolecules，2014，63：200-207.

[5]馬霞，劉永錄，張志輝，等.蜂膠體外對豬細(xì)小病毒感染細(xì)胞能力的影響[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（12）：196-199.

[6]孔祥峰，胡元亮，王德云，等.中藥成分與新城疫病毒感作后對病毒感染活性的影響[J] .南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，27 （2）：90-93.

[7]李雅晶，馮磊，胡福良，等.納米蜂膠對實驗性高脂血癥大鼠脂質(zhì)代謝的影響[J].中國藥學(xué)雜志，2007，42（12）：903-906.

中圖分類號：S852.65+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：0529-6005（2016）05-0096-03

收稿日期：2015-01-16

基金項目：山東省自然科學(xué)基金項目（2011ZRA16002）

作者簡介：馬霞（1978-），女，講師，博士，主要從事中獸藥藥理學(xué)研究，E-mail：maxia801010 @126.com

通訊作者：沈志強，E-mail：bzshenshi@126.com