楊曉偉，于　歡，古少鵬，唐　芳，王仲兵，馮愛梅（.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷0080；.山西省動物疫病預防控制中心，山西太原0007；.汾陽市畜牧局，山西汾陽000）

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5種中藥對常見皮膚癬菌抑菌效果評價

楊曉偉1，于歡1，古少鵬1，唐芳1，王仲兵2，馮愛梅3
（1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷030801；2.山西省動物疫病預防控制中心，山西太原030027；3.汾陽市畜牧局，山西汾陽032200）

摘要：比較了水提法與醇提法對苦參、土荊皮、白鮮皮的提取率，參照美國臨床實驗室標準化委員推薦絲狀真菌藥敏性實驗方案（CLSI M38-A2）分別測定苦參、土荊皮、白鮮皮、瑞香狼毒和蜂膠提取物的對犬小孢子菌、紅色毛癬菌和須毛癬菌的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC），以期為藥物研究提供依據(jù)。結(jié)果顯示：苦參、土荊皮、白鮮皮醇提取法提取率分別為4.317%、7.803%和9.162%，是水提取法的兩倍以上；苦參、土荊皮和白鮮皮乙醇提取物對3種皮膚癬菌的MBC均低于水提取法；蜂膠、狼毒、苦參、白鮮皮和土荊皮醇提取物對3種皮膚癬菌均有良好的殺滅作用，其中以蜂膠的MIC和MBC最低，分別為0.4692 mg/mL～0.93850 mg/mL和0.9385 mg/mL～1.887 mg/mL。

關鍵詞：中藥；皮膚癬菌；CLSI M38-A；抑菌效果

皮膚癬菌病是指由皮膚癬菌引起的表皮（角質(zhì)層）、毛發(fā)、甲板等組織的感染，臨床癥狀表現(xiàn)手足癬、體股癬、頭癬等；常見致病菌有須毛廯菌、犬小孢子菌和紅色毛廯菌等[1]。目前治療皮膚癬菌病主要藥物有抗真菌抗生素，糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，這些藥物雖有一定的療效，但存在抗菌譜窄、易產(chǎn)生耐藥性、毒副作用和促使免疫力降低等問題[2-3]。中草藥來源廣泛、抗真菌化學成分多，不易產(chǎn)生耐藥性和毒副作用小而引起人們重視。研究發(fā)現(xiàn)，土荊皮、白鮮皮和地膚子等水提取物和乙醇提取物對白色念珠菌和糠秕馬拉色菌具有較強抑制活性[4]，蜂膠能夠使細胞壁通透性增強從而發(fā)揮抑菌效應[5]，中藥復方可明顯增強抗真菌作用[6]。因此，研究單味中藥的抗真菌活性對抗真菌復方的研究有重要的意義。

為了探討5種中藥不同提取物對常見感染性真菌的抑菌活性，本試驗依據(jù)美國臨床實驗標準委員會（CLSI）提出方案M38-A[7]，測定了其對犬小孢子菌、須毛癬菌和紅色毛癬菌的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC），以期為進一步研制具有臨床應用價值的抗真菌中藥制劑提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1中藥苦參（產(chǎn)地四川、批次080303）；白鮮皮（產(chǎn)地山東、批次081001）；土荊皮（產(chǎn)地浙江、批次081205），均購自太谷縣仁和大藥房。狼毒乙醇提取物、蜂膠（山西農(nóng)業(yè)大學曹揮、姜玉鎖教授惠贈）。

1.2菌種犬小孢子菌、紅色毛廯菌、須毛癬菌，均由山西農(nóng)業(yè)大學預防獸醫(yī)實驗室分離和按照郭鵬豪[8]鑒定。

1.3主要儀器和試劑超凈工作臺（蘇凈JJ-CT-2FD），立式壓力蒸汽滅菌鍋，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA），循環(huán)水浴多用真空泵，恒溫振蕩器（THZC），血細胞計數(shù)板，96孔酶標板，無水乙醇（批號20141112），RPMI-1640培養(yǎng)液（購自Invitrogen公司）和沙堡勞葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，購自青島海博生物有限公司）。

1.43種中藥有效成分的粗提取

1.4.1乙醇法提取中藥白鮮皮、土荊皮和苦參分別用10倍、8倍和5倍的無水乙醇回流提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，得提取浸膏，干燥后稱量，計算提取率，于4℃冰箱保存。

按公式計X=[w-w1/w]×100%（X表示提取率；W表示樣品重量；W1殘渣重量）計算提取率。

1.4.2去離子水提取中藥白鮮皮、土荊皮和苦參分別用20倍、15倍和4倍的去離子蒸餾水浸泡，在砂鍋中煮沸提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，干燥后稱量，按照1.4.1計算提取率，在4℃冰箱保存。

1.5菌液制備[9]將受試菌接種在SDA培養(yǎng)基，在27℃下培養(yǎng)7 d使其活化，取1 mL的生理鹽水加入試管，用吸管反復輕輕抽吸后，用濾紙滲漏含有孢子和菌絲片段的菌懸液，轉(zhuǎn)入EP管中，通過比濁儀調(diào)整菌懸液為0.2～0.3麥氏單位，并用血細胞計數(shù)板計數(shù)驗證達（1-3）×105CFU/mL，取部分菌懸液用生理鹽水稀釋100倍，吸取0.01 mL菌懸液接種至SDA上，于27℃下孵育和培養(yǎng)，每天觀察有無菌落形成。

1.6中藥提取物體外抑菌活性的試驗參照CL?SI提出的絲狀真菌的藥物敏感方案，將用RPMI-1640稀釋好的中藥提取物加入96孔酶標板中，采用MA-38-A2液體微量稀釋法，測定苦參、土荊皮、白鮮皮乙醇提取物和水提取物以及蜂膠、狼毒乙醇提取物對犬小孢子菌、須毛癬菌和紅色毛癬菌的MIC，并設立灰黃霉素治療組、陽性和陰性對照組，藥物試驗組無真菌生長視為MIC。采用SDA瓊脂平板法測定中藥提取物對各受試菌的MBC值；經(jīng)28℃培養(yǎng)7 d，在SDA培養(yǎng)基上肉眼觀察無真菌生長，視為MBC。

2　結(jié)果

2.13種中藥提取率苦參、土荊皮、白鮮皮醇提取法提取率分別達到4.317%、7.803%和9.162%，為水提取法的兩倍以上，見圖1。

圖1　3種中藥的提取率

2.25種中藥提取物的MIC和MFC苦參和土荊皮乙醇提取物對3種皮膚癬菌的MIC分別為1.509 mg/L～3.018 mg/L和2.033 mg/L～4.067 mg/ L，均低于水提物；白鮮皮醇提取物對須毛癬菌和紅須毛癬菌的MIC分別為4.537 mg/L和2.268 mg/ L，高于水提物；狼毒和蜂膠醇提取物MIC和MBC均低于苦參、土荊皮和白鮮皮提取物；5種中藥醇提取物的MBC為MIC的2～4倍，水提物的MBC 為MIC的2～8倍，5種中藥提取物在該濃度下抑菌和殺菌效果與灰黃霉素相同，詳見表1。

表3抗真菌藥物的MIC和MBC值（mg/L）

3　討論

液體培養(yǎng)基稀釋法、瓊脂稀釋法和瓊脂擴散法是評價抗真菌藥物藥效常用的方法，其試驗結(jié)果受諸多因素的影響，包括菌懸液的濃度，培養(yǎng)基成分、孵育溫度和時間以及不同終點判定方法，目前缺少標準測定皮膚癬菌的試驗方案，針對皮膚癬菌且被廣泛認可的試驗方法正在不斷探索，筆者根據(jù)CLSI M38-A2方案，同時結(jié)合陳劍等皮膚廯菌藥敏試驗結(jié)果及本試驗的前期的摸索，篩選出真菌藥敏試驗條件：菌種在SDA固體培養(yǎng)基27℃培養(yǎng)7 d，菌液濃度為（1-3）×105CFU/ mL，微量板置于濕盒里培養(yǎng)可獲得穩(wěn)定的結(jié)果。

中藥傳統(tǒng)提取方法有煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流法，其中水煎煮法和乙醇浸漬法是常用的方法。本研究發(fā)現(xiàn)乙醇浸責法提取率優(yōu)于水煎煮法，主要原因在于中藥有效成分的熱敏性和極性不同；苦參、土荊皮和白鮮皮的主要活性成分分別為苦參堿、土荊皮酸B和白鮮堿，依據(jù)相似相溶原理，乙醇有利于提取各中藥的有效成分，更好地發(fā)揮其抗真菌的作用，同時由于水煎法溫度高可使某些中藥活性物質(zhì)分解[10]。

5種中藥乙醇提取物對犬小孢子菌、須毛癬菌和紅色毛癬菌均顯示了良好的抑菌活性，其中蜂膠乙醇提取物抑菌活性最高，其MIC范圍為0.4692～0.9385 mg/mL，MFC范圍為0.9385～1.887 mg/mL，并且與灰黃霉素抑菌濃度接近；土荊皮抑菌活性最低，MIC范圍為3.137～6.275 mg/mL，MBC范圍為6.275～12.55 mg/mL。體外抑菌試驗表明，5種中藥乙醇提取物對犬小孢子菌、須毛癬菌和紅色毛癬菌的殺菌效果優(yōu)于水提物；蜂膠乙醇提取物能夠在較低濃度下抑制和殺死真菌，與常用抗真菌藥灰黃霉素濃度相近，顯示了優(yōu)良的殺菌效力；瑞香狼毒其毒性較大，在臨床上容易引起毒性反應和過敏性反應[11]，正確評價瑞香狼毒的毒性可為臨床試驗提供依據(jù)。

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A study on theanti-dermatohytic potential of five medicineplants against thedermatophytes

YANG Xiao-wei1，YU Huan1，GU Shao-peng1，TANG Fang1，WANG Zhong-bing2，F(xiàn)EN Ai-mei3
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Center for Animal Disease Control and Prevention Shanxi，Taiyuan 030024，China；3.Fenyang County Animal Husbandry Bureau，F(xiàn)enyang 030020，China）

Abstract：To provide a basis for the further drug study，we compared the ratio of ethanol and water extractives to radix sopho?rae flavescentis，cortex pseudolaricis，and cortex dictamni，and evaluated the antifungal activity from Stellera chamaejasme L.eu?phorbia，radix sophorae flavescentis，pseudolaricis cortex，cortex dictamni and propolis against the microsporum canis，trichophy?ton mentagrophytes，and trichophyton rubrum by the protocol of CLSI M38-A2.The results showed that for the three Chinese medi?cines，the ratio of ethanol extractives was 4.317%、7.803% and 9.162%，respectively，which was twice as high as the ratio of water extractives.The minimal bactericdal concentration（MBC）of ethanol extractives was lower than the water extractives.The ethanol ex?tractives of the five medicines had an effort on inhibiting the dermatophytes，of which the propolis was the best，and the range of MIC and MBC was 0.4692 mg/mL～0.93850 mg/mL and 0.9385 mg/mL～1.887 mg/mL.

Key words：traditional chinese medicine；dermatophytes；CLSI M38-A；antifungal activity

中圖分類號：S859.3

文獻標志碼：A

文章編號：0529-6005（2016）05-0069-03

收稿日期：2015-03-02

基金項目：山西省科技攻關項目（20130311028-3，201303110-25-3）；“十一五”國家科技支撐計劃（2007BAD56B06-5）

作者簡介：楊曉偉（1988-），男，碩士，主要從事獸醫(yī)公共衛(wèi)生與人畜共患病防治研究，E-mail：769936463@qq.com

通訊作者：古少鵬，E-mail：shpgu@163.com

Corresponding author：GU Shao-peng