李　琴，范迎賽，高宗勤，范　開，劉鐘杰（.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京海淀0093；2.河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河北邯鄲056000）

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女貞子水提液促MC3T3-E1細胞增殖和OPG表達的相關(guān)通路試驗

李琴1，2，范迎賽1，高宗勤1，范開1，劉鐘杰1
（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193；2.河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河北邯鄲056000）

摘要：本試驗以MC3T3-E1細胞為模型細胞，用一定濃度的女貞子水提液組、通路抑制劑（ICI182780、RO318220和PDTC）組，女貞子水提液與通路抑制劑的混合組作用細胞72 h后，用CCK-8法和ELISA法檢測細胞活性及細胞上清中骨保護素（OPG）蛋白水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，女貞子水提液組的細胞活性顯著提高，ICI182780組、RO318220組、水提液+ICI182780混合組和水提液+RO318220混合組細胞活性顯著下降。水提液組OPG蛋白水平顯著提高，3種抑制劑組及3種混合組的OPG蛋白水平均顯著下降；并且女貞子水提液可以加強ICI182780抑制OPG蛋白的作用。表明女貞子水提液可通過ER、PKC和NF-κB通路發(fā)揮促進MC3T3-E1細胞增殖及OPG蛋白表達的作用。

關(guān)鍵詞：女貞子水提液；MC3T3-E1細胞；ER；PKC；NF-κB

女貞子為木犀科植物女貞（Ligustrum lucidum Ait）的干燥果實，具有滋補肝腎，強筋健骨等功效，是一味常用滋補藥。現(xiàn)代藥理研究表明，女貞子具有提高免疫力，抗炎抑菌，降血糖，調(diào)血脂等多方面的功效[1]。目前已有的具有成骨作用中藥研究，集中在骨碎補、肉蓯蓉、補骨脂等偏溫補腎陽藥，而滋補腎陰藥研究相對較少。已有試驗證明，滋陰藥女貞子可以通過促進體外培養(yǎng)的大

鼠成骨細胞的增殖，以及上調(diào)去卵巢大鼠股骨組織中骨保護素（OPG）蛋白的表達來達到強筋壯骨的目的[2-3]。本試驗通過使用抑制劑，研究女貞子水提液對成骨細胞增殖及OPG蛋白表達相關(guān)通路的影響，以期探討女貞子成骨作用機制。

1　試驗材料

1.1MC3T3-E1細胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心。

1.2試驗用藥材及主要試劑女貞子飲片（同仁堂馬連洼藥店，北京）；抑制劑ICI182780，RO318220及PDTC（Sigma公司，美國）；CCK-8試劑盒（同仁化學(xué)研究所，日本）；OPG DoSet ELISA檢測試劑盒（R&D公司，美國）。

圖1　女貞子水提液和ER通路抑制劑對MC3T3-E1細胞活性的影響（n=5）

2　試驗方法

2.1中藥制備精確稱量中藥女貞子50 g，蒸餾水兩次煎煮各30 min，合并濾液，取上清；然后濃縮為1 g/mL藥液，過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆?；臨用前用α MEM培養(yǎng)基配制成10-4mg/mL濃度。3種抑制劑使用DMSO溶解后，臨用前用α MEM配制為20 μmol/L濃度的工作液（DMSO濃度小于0.1%）。本文所用藥物濃度均經(jīng)過預(yù)試驗測定。

2.2女貞子水提液促MC3T3-E1細胞增殖的相關(guān)通路研究將對數(shù)期生長的細胞接種于96孔板中。藥物分組為：（1）20 μmol/L抑制劑（ICI182780，RO318220或PDTC）組；（2）10-5mg/mL女貞子水提液組；（3）混合組：10-5mg/mL女貞子水提液+20 μmol/ L抑制劑；（4）對照組：α MEM培養(yǎng)液，每組5個復(fù)孔。按照CCK-8檢測試劑盒說明書測定吸光值。細胞活性率=各組吸光值/對照組吸光值×100%。

2.3女貞子水提液對MC3T3-E1細胞OPG蛋白表達相關(guān)通路的研究細胞培養(yǎng)及藥物分組同2.2。藥物作用72 h后，吸取上清液，蒸餾水稀釋4倍制成待測樣本。按照ELISA檢測試劑盒說明書測定吸光值。OPG蛋白水平=各組吸光值/對照組吸光值×100%。

2.4數(shù)據(jù)處理所有試驗均重復(fù)2次。采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準差表示。

圖2　女貞子水提液和PKC通路抑制劑對MC3T3-E1細胞活性的影響（n=5）

圖3女貞子水提液和NF-κB通路抑制劑對MC3T3-E1細胞活性的影響（n=5）

3　試驗結(jié)果

3.1女貞子水提液促MC3T3-E1細胞增殖的相關(guān)通路研究

3.1.1雌激素受體（ER）通路（見圖1）與對照組相比，ICI182780組的細胞活性率降至62%（P<0.05），水提液組升至110%（P<0.05)，混合組降至67%（P<0.05）；抑制劑組與混合組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

3.1.2蛋白激酶C（PKC）通路（圖2）與對照組相比，RO318220組的細胞活性率降至79%（P<0.05），水提液組升至110%（P<0.05），混合組降至80%（P<0.05）；抑制劑組與混合組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

3.1.3NF-κB通路（圖3）與對照組相比，PDTC組的細胞活性率無顯著差異（P>0.05），水提液組升至110%（P<0.05），混合組為98%（P>0.05）；抑制劑組與混合組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

3.2女貞子水提液對MC3T3-E1細胞OPG蛋白表達影響的通路研究

3.2.1ER通路（圖4）與對照組相比，ICI182780抑制劑組的OPG蛋白水平降至91%（P<0.05），水提液組OPG水平大于115%（P<0.05），混合組的OPG水平降至83%（P<0.05）；抑制劑組與混合組之間有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。

3.2.2PKC通路（圖5）與對照組相比，RO318220 組OPG蛋白水平降至84%（P<0.05），水提液組的OPG水平大于120%（P<0.05），混合組的蛋白水平降至84%（P<0.05）；抑制劑組與混合組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

圖4　女貞子水提液和ER通路抑制劑對MC3T3-E1細胞OPG蛋白分泌的影響（n=4）

圖5　女貞子水提液和PKC通路抑制劑對MC3T3-E1細胞OPG蛋白分泌的影響（n=4）

3.2.3NF-κB通路（圖6）與對照組相比，PDTC組OPG蛋白水平降至64%（P<0.05），水提液組的OPG水平大于115%（P<0.05），混合組的OPG蛋白水平降至70%（P<0.05）；兩組含抑制劑組之間OPG蛋白水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

4　討論與結(jié)論

OPG、RANK（核因子-κB受體活化因子）及RANKL（核因子-κB受體活化因子配體）參與并調(diào)節(jié)骨吸收與骨形成之間的平衡[4]，在闡明骨質(zhì)疏松癥發(fā)生機制方面具有重要意義。已有研究證明，女貞子的成骨作用與成骨細胞增殖和OPG表達有關(guān)[2-3]。

OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)平衡與ER通路直接相關(guān)[4]，某些中藥促成骨細胞OPG mRNA作用受ER通路的影響[5]。ICI182780是一種ER的特異性拮抗劑[6]，在ER通路的研究中發(fā)揮重要作用。本試驗結(jié)果表明（圖1和圖4），ICI182780能夠顯著降低MC3T3-E1細胞增殖并下調(diào)OPG蛋白表達。圖1顯示，與水提液組相比，混合組細胞活性顯著下降，且與抑制劑組無顯著差異，表明ICI182780可以通過拮抗ER受體完全抑制女貞子水提液的促細胞增殖作用，說明女貞子的促細胞增殖作用與ER通路有關(guān)。圖4顯示，混合組可顯著降低細胞OPG蛋白表達，且與對照組及抑制劑組均有顯著差異，提示抑制劑不僅可以下調(diào)細胞OPG蛋白表達，而且女貞子水提液可以加強ICI182780對OPG蛋白表達的抑制作用，說明女貞子的OPG蛋白表達與ER通路密切相關(guān)，同時還可能有其他作用機制未被闡明，需要進一步研究。

PKC通路也與細胞的生長及多種細胞蛋白的表達相關(guān)。PKC是調(diào)節(jié)OPG蛋白表達與分泌的關(guān)鍵蛋白[4]，并且與下游的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路相關(guān)[7]。RO318220可特異性地抑制PKC[8]。結(jié)果表明（圖2和圖5），RO318220能夠顯著降低MC3T3-E1細胞的細胞增殖率和OPG蛋白表達水平，說明PKC對MC3T3-E1細胞增殖和OPG蛋白表達起到重要作用。與對照組相比，混合組的細胞活性率和OPG蛋白表達水平顯著下降，且與RO318220組無顯著差異，提示PKC抑制劑可以完全抑制女貞子水提液的促細胞增殖及促OPG蛋白表達作用，即女貞子水提液促細胞增殖和促OPG蛋白表達作用與PKC通路相關(guān)。

NF-κB是一種多功能的轉(zhuǎn)錄因子，與免疫應(yīng)答、細胞的增殖與凋亡等相關(guān)[9]，OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)的信號級聯(lián)反應(yīng)中包括NF-κB的活化[4]。PDTC能夠抑制NF-κB磷酸化，可作為NF-κB通路抑制劑研究[10]。圖3中PDTC組與對照組沒有統(tǒng)計學(xué)差異，說明MC3T3-E1細胞增殖與NF-κB的磷酸化無關(guān)；而混合組與水提液組相比顯著降低，說明PDTC可以抑制女貞子的促細胞增殖作用，即女貞子水提液促進MC3T3-E1細胞增殖與NF-κB的磷酸化相關(guān)。圖6顯示，PDTC可下調(diào)細胞OPG蛋白表達，說明細胞OPG蛋白表達水平與NF-κB的磷酸化有關(guān)；與水提液組相比，混合組OPG蛋白水平顯著下調(diào)，表明PDTC可以顯著抑制水提液促OPG蛋白表達的作用，提示細胞OPG蛋白表達與NF-κB的磷酸化有關(guān)；混合組與抑制劑組的OPG水平雖然沒有差異，但是表達水平略有上調(diào)，推測PDTC并不能完全抑制女貞子水提液的促蛋白表達作用。

本試驗證明，女貞子水提液可通過ER、PKC 和NF-κB通路發(fā)揮促進MC3T3-E1細胞增殖及OPG蛋白表達的作用。

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Study on signaling pathways of FructusLigustri Lucidi water extracts-induced cell proliferation and OPG expression

LI Qin1，2，F(xiàn)AN Ying-sai1，GAO Zong-qin1，F(xiàn)AN Kai1，LIU Zhong-jie1
（1.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2.College of Agriculture HeBei University Engineering，Handan 056000，China）

Abstract：Cell line MC3T3-E1 was used as cell model in this study.A certain concentration of Fructus Ligustri Lucidi water extracts，signaling pathways inhibitors（ICI182780、RO318220 and PDTC），and mixture of water extracts and inhibitors were add?ed in cell culture for 72 h，and then the cell proliferation and OPG protein level in the cell supernatant were tested using CCK-8 and ELISA assay.The results showed that，compared with the control group，the cell activity of Fructus Ligustri Lucidi water ex?tracts group was remarkably increased.However the cell activity of ICI182780 group，RO318220 group，mixture of water extracts and ICI182780 group，and mixture of water extracts and RO318220 group was remarkably decreased.The OPG level of water ex?tracts group was remarkably up-regulated，while the OPG level of three inhibitor groups and three mixture groups was remarkably down-regulated，and the Fructus Ligustri Lucidi water extracts could strengthen the inhibition of ICI182780 on OPG expression. In conclusion，the Fructus Ligustri Lucidi water extracts can promote the proliferation and OPG protein expression of the osteoblasts via ER，PKC and NF-κ B signaling pathways.

Key words：Fructus Ligustri Lucidi water extracts；MC3T3-E1 cell line；ER；PKC；NF-κ B

中圖分類號：S859.3

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：0529-6005（2016）05-0059-03

收稿日期：2014-12-17

作者簡介：李琴（1987-），女，講師，博士，研究方向為中獸醫(yī)學(xué)，E-mail：funinside@sina.com

通訊作者：劉鐘杰，E-mail：liuzhongjiecau@163.com

Corresponding author：LIU Zhong-jie