張　敏，戴愛玲，2，孫艷發(fā)，李曉華，2，楊小燕，2，黃美璇（.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖36402；2.福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建龍巖36402）

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閩西地區(qū)豬丹毒桿菌的分離及生物特性鑒定

張敏1，戴愛玲1，2，孫艷發(fā)1，李曉華1，2，楊小燕1，2，黃美璇1
（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖364012；2.福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建龍巖364012）

摘要：為確診福建省龍巖市范圍內(nèi)4個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)疑似豬丹毒病例，從病豬臟器中分離、純化細(xì)菌，并進(jìn)行生物特性鑒定。根據(jù)其培養(yǎng)特性、形態(tài)特征、生化試驗(yàn)及PCR鑒定，確定為豬丹毒桿菌。16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果表明，4株分離株16S rRNA序列全部相同，與GenBank中NR_074878_Fujisawa、NR_040871_DSM_14972、NR_113036_JCM_8533、NR_04083-7_ATCC 19414同源性為98.7%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，4株分離株對(duì)阿莫西林、頭孢噻呋、替米考星高度敏感；對(duì)慶大霉素、恩諾沙星產(chǎn)生耐藥；對(duì)林可霉素、泰妙菌素、氟苯尼考、土霉素敏感性存在差異，其中LY-WP株對(duì)林可霉素耐受，LY-CT株對(duì)土霉素耐受。

關(guān)鍵詞：豬丹毒桿菌；分離；鑒定；閩西地區(qū)

豬丹毒是由豬丹毒桿菌引起的一種急性、熱性、人獸共患傳染病，豬感染后出現(xiàn)皮膚疹塊、關(guān)節(jié)炎和敗血癥，人感染后表現(xiàn)為類丹毒癥狀。上世紀(jì)末豬丹毒位列中國養(yǎng)豬業(yè)3大傳染病之一，之后隨著養(yǎng)豬生產(chǎn)的不斷規(guī)范化，急性典型性病例顯著減少。近年來福建、安徽、江西、廣東等省不斷出現(xiàn)豬丹毒散發(fā)報(bào)道，豬丹毒呈現(xiàn)卷土重來之勢(shì)。

2014年4-7月龍巖學(xué)院先后接診4個(gè)豬場(chǎng)疑似豬丹毒病例。本文對(duì)疑似病例病料進(jìn)行細(xì)菌分離，對(duì)分離到的疑似菌株進(jìn)行常規(guī)的染色鑒定、生化鑒定、16S rRNA基因序列分析，確定為豬丹毒桿菌，并通過藥敏試驗(yàn)掌握其耐藥情況，報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1病料來源無菌采取急性死亡豬只心臟、肝臟、肺臟、脾臟組織。

1.2主要試劑胰蛋白大豆肉湯（TSB），購自北京希凱創(chuàng)新科技有限公司；生化鑒定管、藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；胎牛血清（FBS），購自杭州四季青生物工程材料有限公司；PCR Taq Mix、2 000 bp Marker、瓊脂糖、pMD18-T載體、DH5α，購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；其他常規(guī)試劑由福建省龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.3引物引用文獻(xiàn)[2]報(bào)道引物，P-up：5′-TGA?CATACCGCGCAAAAGCA-3′；P-down：5′-GGCTCC CTCCTAGTAAACTA-3′。由上海華津生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4細(xì)菌分離純化將病料分別接種于5% FBS-TSA平板，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取表面光滑、針尖大小的圓形單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色，鏡檢，觀察其形態(tài)特征；再分別挑取疑似單個(gè)菌落接種于5% FBS-TSA平板，37℃恒溫箱內(nèi)進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.5生化試驗(yàn)分離菌株的純培養(yǎng)物接種于糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h～48 h，觀察發(fā)酵情況；另將其接種于明膠培養(yǎng)基中，置于20℃培養(yǎng)，觀察5 d。

1.6細(xì)菌PCR鑒定采用CTAB/NaCl方法提取細(xì)菌基因組DNA作為PCR模板。PCR反應(yīng)體系為：2×PCR Taq Mix 12.5 μL，引物P-up/P-down各1 μL，模板DNA 1 μL，加滅菌超純水至25 μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃，5 min；94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃，10 min；同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。取PCR產(chǎn)物5 μL加入上樣緩沖液后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀觀察并記錄結(jié)果。

1.7PCR產(chǎn)物的克隆、測(cè)序及序列分析回收PCR擴(kuò)增目的片段，連于pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒送上海華津生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。運(yùn)用DNAStar軟件與GenBank公布的豬丹毒桿菌16S rRNA基因進(jìn)行序列分析。

1.8藥敏試驗(yàn)將純培養(yǎng)菌液稀釋100倍后均勻涂布于5%FBS-TSA表面，用無菌鑷將阿莫西林、頭孢噻呋、林可霉素、泰妙菌素、替米考星、慶大霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、土霉素藥敏紙片緊貼于瓊脂表面，37℃恒溫培養(yǎng)，18 h后觀察結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1細(xì)菌的形態(tài)特征經(jīng)過純培養(yǎng)先后得到4株分離菌株，分別命名為LY-WP株、LY-CT株、LYXL株、JX-RJ株。在5%FBS-TSA平板上長出針尖大小菌落、灰白色、透明、圓形、表面光滑。細(xì)菌革蘭染色陽性，呈現(xiàn)長短不一桿狀，甚至長絲狀，無芽孢和莢膜，見圖1。

圖1　豬丹毒分離株革蘭染色結(jié)果（10×100）

2.2細(xì)菌生化鑒定結(jié)果生化鑒定管37℃培養(yǎng)48 h后，觀察到4株分離株均能發(fā)酵乳糖、葡萄糖；但不能發(fā)酵甘露醇、蔗糖、麥芽糖、阿拉伯糖。明膠穿刺經(jīng)20℃培養(yǎng)5 d后，4株菌株均可觀察到細(xì)菌沿穿刺線呈試管刷狀生長，不液化明膠。

2.3細(xì)菌PCR鑒定結(jié)果對(duì)純培養(yǎng)的分離株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，被檢菌株均在472 bp處出現(xiàn)特異性條帶，片段大小與預(yù)期一致（見圖2）。

圖2　16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果M：Marker；1：LY-WP株；2：LY-CT株；3：LY-XL株；4：JX-RJ株；5：陰性對(duì)照

2.4分離株16S rRNA基因序列分析結(jié)果將4株分離株P(guān)CR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，擴(kuò)增序列完全相同。采用NCBI網(wǎng)站中的BLAST工具，將分離菌株16S rRNA與GenBank中的序列進(jìn)行比較，分離株16S rRNA與GenBank中NR_074878_Fujisawa、NR_040871_DSM_14972、NR_113036_JCM_8533、NR_ 040837_ATCC 19414同源性為98.7%，（見圖3）。

2.5藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)4株豬丹毒桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，4株分離株均對(duì)阿莫西林、頭孢噻呋、替米考星高度敏感；對(duì)慶大霉素、恩諾沙星產(chǎn)生耐藥；而對(duì)林可霉素、泰妙菌素、氟苯尼考、土霉素敏感性存在差異，其中LYWP株對(duì)林可霉素耐受，LY-CT株對(duì)土霉素耐受。

3　討論

近年來，規(guī)?；i場(chǎng)重視豬瘟、豬偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征等病毒病的防控，放松了對(duì)細(xì)菌病的警惕，豬丹毒呈現(xiàn)死灰復(fù)燃趨勢(shì)，我國各省均有不同程度散發(fā)病例。

福建省是養(yǎng)豬大省，龍巖市位于閩西地區(qū)，是福建省生豬出欄和豬肉產(chǎn)品的重要基地之一。2014年4-7月龍巖學(xué)院先后接診4例疑似豬丹毒病例。通過細(xì)菌分離得到灰白色、透明、針尖大小菌落，革蘭染色為陽性桿菌。純培養(yǎng)之后檢測(cè)了其生化特性，基本符合豬丹毒桿菌的生物學(xué)特性，但與國內(nèi)報(bào)道福建分離株存在部分差異，如車勇良等報(bào)道的福建分離株不能發(fā)酵葡萄糖[3]，而本試驗(yàn)4株分離株均能發(fā)酵葡萄糖。采用PCR技術(shù)進(jìn)一步鑒定，在472 bp處出現(xiàn)特異性目的條帶。對(duì)擴(kuò)增到的16S rRNA片段進(jìn)行序列分析，其與GenBank中報(bào)道的NR_074878_Fujisawa、NR_040871_DSM_14972、NR_113036_JCM_8533、NR_040837_ATCC 19414同源性為98.7%，說明核苷酸保守性較好且穩(wěn)定。

作為細(xì)菌性豬病，豬丹毒很容易用抗生素控制住，但易產(chǎn)生耐受現(xiàn)象。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，4株分離株對(duì)頭孢類藥物阿莫西林、頭孢噻呋仍然高度敏感，與國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[4-5]；對(duì)氨基糖苷類抗生素慶大霉素耐受，與陸萍[6]、薛輝[7]報(bào)道一致；LY-WP株對(duì)林可霉素耐受，LYCT株對(duì)土霉素耐受，與鄒垚[8]報(bào)道一致。

參考文獻(xiàn)：

[1] Zhang A，Xu C，Wang H，et al . Presence and new genetic envi?ronment of pleuromutilin-lincosamide-streptogramin A resistance gene lsa（E）in Erysipelothrix rhusiopathiae of swine origin[J].Vet?erinary microbiology，2015，177（1）：162-167.

[2]譚侃侃.丹毒絲菌的分離鑒定及其SpaA-N蛋白和lipo蛋白的免疫原性分析[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[3]車勇良，陳如敬，王隆柏，等.豬丹毒桿菌的分離鑒定及其SpaA基因的遺傳變異分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，31（11）：1591-1593.

[4]金璐娟.一株豬丹素桿菌的分離與鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2007（10）：87-88.

[5]何世成，談志祥，劉道新，等.3株豬紅斑丹毒絲菌湖南株的分離與鑒定[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（5）：155-158.

[6]陸萍，黃曉慧，李春芬，等.安徽部分地區(qū)豬丹毒桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究[J] .微生物學(xué)通報(bào)，2014，41（9）：1822-1828.

[7]薛輝，秦樹英，於慶雄，等.廣西豬丹毒桿菌分離鑒定及生物學(xué)特性研究[J].養(yǎng)豬，2014（6）：97-100.

[8]鄒垚，朱曉明，苑文濤，等.1株豬丹毒桿菌的分離與鑒定[J].畜牧與獸醫(yī)，2015，47（2）：11-14.

中圖分類號(hào)：S852.65+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529-6005（2016）05-0045-02

收稿日期：2015-11-05

作者簡介：張敏（1983-），女，講師，博士，主要從事動(dòng)物病原檢測(cè)，E-mail：zhangminshiwo@163.com

通訊作者：戴愛玲，E-mail：ailing114@163.com